Direkte sammenligning af hyperspektral stimuleret Raman-spredning og sammenhængende anti-stokes Raman-spredningsmikroskopi til kemisk billeddannelse

Summary

Dette papir sammenligner direkte opløsning, følsomhed og billedkontraster af stimuleret Raman-spredning (SRS) og sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) integreret i den samme mikroskopplatform. Resultaterne viser, at CARS har en bedre rumlig opløsning, SRS giver bedre kontraster og spektral opløsning, og begge metoder har samme følsomhed.

Abstract

Stimuleret Raman-spredning (SRS) og sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) mikroskopi er de mest anvendte sammenhængende Raman-spredningsteknologier. Hyperspektral SRS- og CARS-billeddannelse tilbyder Raman-spektral information ved hver pixel, hvilket muliggør bedre adskillelse af forskellige kemiske sammensætninger. Selvom begge teknikker kræver to excitationslasere, er deres signaldetekteringsordninger og spektrale egenskaber helt forskellige. Målet med denne protokol er at udføre både hyperspektral SRS- og CARS-billeddannelse på en enkelt platform og sammenligne de to mikroskopiteknikker til billeddannelse af forskellige biologiske prøver. Den spektrale fokuseringsmetode anvendes til at erhverve spektral information ved hjælp af femtosekundlasere. Ved at bruge standard kemiske prøver sammenlignes følsomheden, rumlig opløsning og spektralopløsning af SRS og CARS under de samme exciteringsforhold (dvs. effekt ved prøven, pixelopholdstid, objektiv linse, pulsenergi). Billedkontrastene for CARS og SRS for biologiske prøver sidestilles og sammenlignes. Den direkte sammenligning af CARS- og SRS-præstationer ville give mulighed for optimal udvælgelse af modaliteten til kemisk billeddannelse.

Introduction

Raman-spredningsfænomenet blev først observeret i 1928 af C. V. Raman¹. Når en hændelsesfoton interagerer med en prøve, kan der spontant forekomme en uelastisk spredningshændelse, hvor fotonens energiændring matcher en vibrationsovergang af den analyserede kemiske art. Denne proces kræver ikke brug af et kemisk mærke, hvilket gør det til et alsidigt, etiketfrit værktøj til kemisk analyse, samtidig med at prøveforstyrrelser minimeres. På trods af sine fordele lider spontan Raman-spredning af et lavt spredningstværsnit (typisk 10¹¹ lavere end det infrarøde [IR] absorptionstværsnit), hvilket nødvendiggør lange anskaffelsestider for analyse². Således er søgen efter at øge følsomheden af Raman-spredningsprocessen afgørende for at skubbe Raman-teknologier til billeddannelse i realtid.

En effektiv måde at forbedre følsomheden af Raman-spredning i høj grad er gennem sammenhængende Raman-spredningsprocesser (CRS), for hvilke to laserimpulser typisk bruges til at excitere molekylære vibrationsovergange ^3,4. Når fotonenergiforskellen mellem de to lasere matcher prøvemolekylernes vibrationstilstande, genereres stærke Raman-signaler. De to mest almindeligt anvendte CRS-processer til billeddannelse er sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) og stimuleret Raman-spredning (SRS)⁵. I løbet af de sidste to årtier har den teknologiske udvikling avanceret CARS- og SRS-mikroskopiteknikker til at blive kraftfulde værktøjer til mærkningsfri kvantificering og belysning af kemiske ændringer i biologiske prøver.

Kemisk billeddannelse ved CARS mikroskopi kan dateres til 1982, da laserscanning først blev anvendt til at erhverve CARS-billeder, demonstreret af Duncan et al⁶. Moderniseringen af CARS-mikroskopi blev kraftigt fremskyndet efter de brede anvendelser af laserscanning multiphoton fluorescensmikroskopi⁷. Tidligt arbejde fra Xie-gruppen ved hjælp af lasere med høj gentagelseshastighed har overført CARS til at være en højhastigheds, etiketfri, kemisk billeddannelsesplatform til karakterisering af molekyler i biologiske prøver ^8,9,10. Et af de største problemer for CARS-billeddannelse er tilstedeværelsen af en ikke-resonant baggrund, hvilket reducerer billedkontrasten og forvrænger Raman-spektret. Der er gjort mange bestræbelser på enten at reducere den ikke-resonante baggrund 11,12,13,14,15 eller at udtrække resonans Raman-signaler fra CARS-spektrene ^16,17. Et andet fremskridt, der i høj grad har avanceret feltet, er hyperspektral CARS-billeddannelse, som giver mulighed for spektral kortlægning ved hver billedpixel med forbedret kemisk selektivitet 18,19,20,21.

Stimuleret Raman spredning (SRS) er en yngre billeddannelsesteknologi end CARS, selvom den blev opdaget tidligere²². I 2007 blev SRS-mikroskopi rapporteret ved hjælp af en laserkilde med lav gentagelseshastighed²³. Snart demonstrerede flere grupper højhastigheds SRS-billeddannelse ved hjælp af lasere med høj gentagelseshastighed 24,25,26. En af de største fordele ved SRS-mikroskopi i forhold til CARS er fraværet af den ikke-resonante baggrund²⁷, selvom andre baggrunde såsom tværfasemodulation (XPM), forbigående absorption (TA), to-fotonabsorption (TPA) og fototermisk (PT) effekt kan forekomme med SRS²⁸. Derudover har SRS-signalet og prøvekoncentrationen lineære forhold, i modsætning til CARS, som har en kvadratisk signalkoncentrationsafhængighed²⁹. Dette forenkler kemisk kvantificering og spektral ublanding. Flerfarvet og hyperspektral SRS har udviklet sig i forskellige former 30,31,32,33,34,35,36, hvor spektralfokusering er en af de mest populære tilgange til kemisk billeddannelse ^37,38.

Både CARS og SRS kræver fokusering af pumpen og Stokes laserstråler på prøven for at matche molekylernes vibrationsovergang til signal excitation. CARS og SRS mikroskoper deler også meget til fælles. Imidlertid har fysikken bag disse to processer og signaldetektioner involveret i disse mikroskopiteknologier forskelle ^3,39. CARS er en parametrisk proces, der ikke har netto fotonmolekyle energikobling³. SRS er imidlertid en ikke-parametrisk proces og bidrager til energioverførsel mellem fotoner og molekylære systemer²⁷. I CARS genereres et nyt signal ved anti-Stokes-frekvens, mens SRS manifesterer sig som energioverførslen mellem pumpen og Stokes laserstråler.

CARS signal opfylder Eq (1)²⁸.

(1)

I mellemtiden kan SRS-signal skrives som Eq (2)²⁸.

(2)

Her er I_p, I_s, I_CARS og ΔI_SRS intensiteten af henholdsvis pumpebjælken, Stokes-strålen, CARS-signalet og SRS-signalerne. χ⁽³⁾ er prøvens tredjeordens ikke-lineære optiske modtagelighed og er en kompleks værdi sammensat af reelle og imaginære dele.

Disse ligninger udtrykker spektralprofilerne og signalkoncentrationsafhængigheden af CARS og SRS. Forskelle i fysik resulterer i forskellige detektionsordninger for disse to mikroskopiteknologier. Signaldetektion i CARS involverer normalt spektral adskillelse af nyligt genererede fotoner og detektion ved hjælp af et fotomultiplierrør (PMT) eller ladningskoblet enhed (CCD); for SRS måles energiudvekslingen mellem pumpen og Stokes-strålerne normalt ved højhastighedsintensitetsmodulation ved hjælp af en optisk modulator og demodulation ved hjælp af en fotodiode (PD) parret med en låseforstærker.

Selv om der i de senere år er blevet offentliggjort mange teknologiske udviklinger og anvendelser inden for både CARS- og SRS-områder, er der ikke foretaget systematiske sammenligninger af de to CRS-teknikker på samme platform, især for hyperspektral CARS- og SRS-mikroskopi. Direkte sammenligninger i følsomhed, rumlig opløsning, spektral opløsning og kemiske separationsfunktioner ville give biologer mulighed for at vælge den bedste modalitet til kemisk kvantificering. I denne protokol gives detaljerede trin til konstruktion af en multimodal billeddannelsesplatform med både hyperspektrale CARS- og SRS-modaliteter baseret på et femtosekundlasersystem og spektralfokusering. De to teknikker er blevet sammenlignet i fremadgående retning for spektral opløsning, detektionsfølsomhed, rumlig opløsning og billedkontraster af celler.

Protocol

1. Instrumentel opsætning til hyperspektral CRS-billeddannelse BEMÆRK: Genereringen af CRS-signal kræver brug af højeffektlasere (dvs. klasse 3B eller klasse 4). Sikkerhedsprotokoller skal behandles, og der skal altid bæres korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE), når der arbejdes med så høje spidsbelastninger. Se korrekt dokumentation inden eksperimentering. Denne protokol fokuserer på at designe strålebanen, kvidre femtosekundimpulserne og optimere billeddannelse…

Representative Results

Sammenligninger af spektralopløsningenFigur 2 sammenligner spektralopløsningen af hyperspektral SRS (figur 2A) og CARS (figur 2B) mikroskopi ved hjælp af en DMSO-prøve. For SRS-spektret blev to lorentziske funktioner (se protokoltrin 2.3) anvendt til at passe til spektret, og en opløsning på 14,6 cm-1 blev opnået ved anvendelse af toppen på 2.913 cm-1 . For CARS blev en to-peak-fitt…

Discussion

Protokollen, der præsenteres her, beskriver konstruktionen af et multimodalt CRS-mikroskop og den direkte sammenligning mellem CARS- og SRS-billeddannelse. For mikroskopkonstruktionen er de kritiske trin rumlig og tidsmæssig stråleoverlapning og optimering af strålestørrelse. Det anbefales at bruge en standardprøve som DMSO før den biologiske billeddannelse til optimering af SNR og kalibrering af Raman-skift. Direkte sammenligning mellem CARS- og SRS-billeder afslører, at CARS har en bedre rumlig opløsning, mens…

Materials

2D galvo scanner set	Thorlabs	GVS002
Acousto-optic modulator	Isomet	M1205-P80L-0.5
AOM driver	Isomet	532B-2
Data acquisition card	National Instruments	PCle 6363	Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage	Zaber	X-LSM050A
Deuterium oxide	Millipore Sigma	151882-100G
Dichroic mirror for beam combination	Thorlabs	DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation	Semrock	FF776-Di01-25×36
DMSO	MiliporeSigma	200-664-3
MIA PaCa 2 Cells	ATCC	CRL-1420
Femtosecond laser system	Spectral Physics	InSightX3+
Filter for CARS	Chroma	AT655/30m
Filter for SRS	Chroma	ET980sp
Function generator	Rigol	DG1022Z
Glass rods	Lattice Electro Optics	SF-57
Half-wave plate	Newport	10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020	National Instruments		This is the image acquisition software
Lock-in amplifier	Zurich Instrument	HF2LI
Microscope housing	Olympus	BX51W1
Objective lens	Olympus	UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b	OriginLab Corporation		This is the spectral fitting software
Oscilloscope	Tektronix	TBS2204B
Photodiode	Hamamatsu	S3994-01
PMT detector	Hamamatsu	H7422P-40
PMT voltage amplifier	Advanced Research Instrument Corp.	PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube	Thorlabs	PBS255
Terminal block	National Instruments	BNC-2110