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화학

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

Published: April 28, 2022
doi:
10.3791/63677
, , , ,
1Department of Chemistry,Purdue University

Summary

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

Abstract

자극된 라만 산란(SRS) 및 일관된 스토크스 라만 산란(CARS) 현미경은 가장 널리 사용되는 일관된 라만 산란 영상 기술입니다. 하이퍼스펙트럼 SRS 및 CARS 이미징은 모든 픽셀에서 라만 스펙트럼 정보를 제공하므로 다양한 화학 성분을 더 잘 분리할 수 있습니다. 두 기술 모두 두 개의 여기 레이저가 필요하지만 신호 감지 체계와 스펙트럼 특성은 상당히 다릅니다. 이 프로토콜의 목표는 단일 플랫폼에서 하이퍼스펙트럼 SRS 및 CARS 이미징을 모두 수행하고 서로 다른 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 두 현미경 기술을 비교하는 것입니다. 스펙트럼 초점 방법은 펨토초 레이저를 사용하여 스펙트럼 정보를 획득하기 위해 사용된다. 표준 화학 샘플을 사용함으로써, 동일한 여기 조건(즉, 샘플에서의 전력, 픽셀 체류 시간, 대물 렌즈, 펄스 에너지)에서 SRS 및 CARS의 감도, 공간 분해능 및 스펙트럼 분해능을 비교한다. 생물학적 샘플에 대한 CARS 및 SRS의 이미징 콘트라스트는 병치되고 비교됩니다. CARS와 SRS 성능을 직접 비교하면 화학 이미징을위한 양식을 최적으로 선택할 수 있습니다.

Introduction

라만 산란 현상은 1928년 C. V. 라만1에 의해 처음 관찰되었다. 입사 광자가 샘플과 상호 작용할 때, 비탄성 산란 사건이 자발적으로 발생할 수 있으며, 여기서 광자의 에너지 변화는 분석 된 화학 종의 진동 전이와 일치합니다. 이 공정은 화학 태그를 사용할 필요가 없으므로 시료 교란을 최소화하면서 화학 분석을위한 다용도의 라벨이없는 도구입니다. 장점에도 불구하고, 자발적인 라만 산란은 낮은 산란 단면 (일반적으로 적외선 [IR] 흡수 단면보다10,11 낮음)을 앓고 있으며, 이는 분석2를 위해 긴 획득 시간을 필요로합니다. 따라서, 라만 산란 공정의 감도를 증가시키기 위한 탐구는 실시간 이미징을 위한 라만 기술을 추진하는데 필수적이다.

라만 산란의 감도를 크게 향상시키는 한 가지 효과적인 방법은 일관된 라만 산란 (CRS) 프로세스를 사용하는 것이며, 일반적으로 두 개의 레이저 펄스가 분자 진동 전이 3,4를 자극하는 데 사용됩니다. 두 레이저 사이의 광자 에너지 차이가 샘플 분자의 진동 모드와 일치하면 강한 라만 신호가 생성됩니다. 이미징을 위해 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 CRS 프로세스는 일관된 안티 스토크스 라만 산란 (CARS)과 자극 라만 산란 (SRS)5입니다. 지난 이십 년 동안 기술 개발은 CARS 및 SRS 현미경 검사 기술을 발전시켜 생물학적 샘플의 화학적 변화에 대한 라벨 없는 정량화 및 해명을위한 강력한 도구가되었습니다.

CARS 현미경에 의한 화학 이미징은 Duncan et al6에 의해 입증 된 CARS 이미지를 얻기 위해 레이저 스캐닝이 처음 적용되었을 때 1982 년으로 거슬러 올라갈 수 있습니다. CARS 현미경의 현대화는 레이저 스캐닝 다중 광자 형광 현미경7의 광범위한 적용 후에 크게 가속화되었습니다. 높은 반복률 레이저를 사용하는 Xie 그룹의 초기 연구는 CARS를 생물학적 샘플 8,9,10에서 분자의 특성화를위한 고속, 라벨이없는 화학 이미징 플랫폼으로 전환했습니다. CARS 이미징의 주요 문제 중 하나는 비공진 배경의 존재로 이미지 대비가 감소하고 라만 스펙트럼이 왜곡된다는 것입니다. 비공진 배경 11,12,13,14,15를 감소시키거나 CARS 스펙트럼(16,17)으로부터 공진 라만 신호를 추출하기 위해 많은 노력이 이루어졌다. 이 분야를 크게 발전시킨 또 다른 발전은 하이퍼 스펙트럼 CARS 이미징으로, 화학적 선택성18,19,20,21이 향상된 각 이미지 픽셀에서 스펙트럼 매핑을 허용합니다.

자극 라만 산란 (SRS)은 CARS보다 젊은 이미징 기술이지만22 년 초에 발견되었습니다. 2007년에, SRS 현미경은 낮은 반복률 레이저 소스(23)를 사용하여 보고되었다. 곧, 몇몇 그룹은 높은 반복률 레이저24,25,26을 사용하여 고속 SRS 이미징을 시연했습니다. CARS에 대한 SRS 현미경 검사의 주요 장점 중 하나는 비공진 배경(27)의 부재이지만, 교차 위상 변조(XPM), 과도 흡수(TA), 이광자 흡수(TPA) 및 광열(PT) 효과와 같은 다른 배경은 SRS(28)에서 발생할 수 있다. 또한, SRS 신호 및 샘플 농도는 CARS와 달리 선형 관계를 가지며, 이는 직교 신호-농도 의존성(29)을 갖는다. 이것은 화학적 정량화와 스펙트럼 언믹싱을 단순화합니다. 다색 및 하이퍼스펙트럼 SRS는 30,31,32,33,34,35,36 형태로 진화해 왔으며, 스펙트럼 초점은 화학 이미징 37,38에 대한 가장 보편적인 접근법 중 하나이다.

CARS와 SRS 모두 신호 여기를 위한 분자의 진동 전이와 일치하도록 펌프와 스토크스 레이저 빔을 샘플에 집중해야 합니다. CARS 및 SRS 현미경도 공통점이 많습니다. 그러나 이러한 두 프로세스의 근간이 되는 물리학과 이러한 현미경 기술에 관련된 신호 검출은3,39의 불균형을 가지고 있습니다. CARS는 순 광자-분자 에너지 커플링3을 갖지 않는 파라메트릭 공정이다. 그러나, SRS는 비모수 프로세스이며, 광자와 분자 시스템(27) 사이의 에너지 전달에 기여한다. CARS에서는 스토크스 방지 주파수에서 새로운 신호가 생성되고, SRS는 펌프와 스토크스 레이저 빔 사이의 에너지 전달로 나타납니다.

CARS 신호는 Eq (1)28을 만족한다.

Equation 1 (1)

한편, SRS 신호는 Eq(2)28로서 기입될 수 있다.

Equation 1(2)

여기서, I p, Is, I CARS 및 ΔI SRS는 각각 펌프 빔, 스토크스 빔, CARS 신호 및 SRS 신호의 강도이다. χ(3)은 샘플의 3차 비선형 광학 감수성이며, 실제 및 허수 부분으로 구성된 복합 값입니다.

이들 방정식은 CARS 및 SRS의 스펙트럼 프로파일과 신호-농도 의존성을 표현한다. 물리학의 차이는이 두 현미경 기술에 대한 이질적인 검출 체계를 초래합니다. CARS에서의 신호 검출은 일반적으로 새로 생성된 광자의 스펙트럼 분리 및 광승수 튜브(PMT) 또는 전하 결합 장치(CCD)를 사용한 검출을 포함한다. SRS의 경우, 펌프와 스토크스 빔 사이의 에너지 교환은 일반적으로 광 변조기를 사용하는 고속 강도 변조 및 록인 증폭기와 페어링된 광 다이오드(PD)를 사용한 복조로 측정됩니다.

최근 몇 년 동안 CARS 및 SRS 분야에서 많은 기술 개발 및 응용 프로그램이 발표되었지만 두 CRS 기술에 대한 체계적인 비교는 동일한 플랫폼, 특히 하이퍼 스펙트럼 CARS 및 SRS 현미경에 대해 수행되지 않았습니다. 감도, 공간 분해능, 스펙트럼 분해능 및 화학적 분리 능력을 직접 비교하면 생물학자가 화학 정량화에 가장 적합한 형식을 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 펨토초 레이저 시스템 및 스펙트럼 포커싱을 기반으로 하이퍼스펙트럼 CARS 및 SRS 형식을 모두 갖춘 멀티모달 이미징 플랫폼을 구축하기 위한 상세한 단계가 제공됩니다. 두 기술은 스펙트럼 해상도, 검출 감도, 공간 해상도 및 세포의 이미징 대비를 위해 전진 방향으로 비교되었습니다.

Protocol

1. 하이퍼스펙트럼 CRS 이미징을 위한 도구 설정 참고: CRS 신호를 생성하려면 고전력(즉, 클래스 3B 또는 클래스 4) 레이저를 사용해야 합니다. 안전 프로토콜을 해결해야 하며 이러한 높은 피크 전력에서 작업할 때 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 실험하기 전에 적절한 문서를 참조하십시오. 이 프로토콜은 빔 경로 설계, 펨토초 펄스 치핑, 이미징…

Representative Results

스펙트럼 해상도의 비교도 2는 DMSO 샘플을 이용한 하이퍼스펙트럼 SRS(도 2A) 및 CARS(도 2B) 현미경의 스펙트럼 분해능을 비교한다. SRS 스펙트럼의 경우, 스펙트럼에 맞게 두 개의 로렌치안 함수(프로토콜 단계 2.3 참조)를 적용하고, 2,913cm-1 피크를 사용하여 14.6cm-1의 분해능을 얻었다. CARS의 경우, 가우?…

Discussion

여기에 제시된 프로토콜은 다중 모드 CRS 현미경의 구축과 CARS와 SRS 이미징 간의 직접적인 비교를 설명합니다. 현미경 제작의 중요한 단계는 공간 및 시간적 빔 중첩 및 빔 크기 최적화입니다. SNR을 최적화하고 라만 이동을 교정하기 위해 생물학적 이미징 전에 DMSO와 같은 표준 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. CARS와 SRS 이미지를 직접 비교하면 CARS가 더 나은 공간 해상도를 갖는 반면, SRS는 더 나은 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 퍼듀 대학 화학과 스타트업 펀드의 지원을 받았다.

Materials

2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25×36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110
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References

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Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).
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