La génétique inverse pour concevoir des variants du virus à ARN à sens positif

Summary

Le protocole décrit une méthode permettant d’introduire une diversité génétique contrôlable dans le génome du virus de l’hépatite C en combinant la synthèse d’ARN mutant sur toute la longueur à l’aide de la PCR sujette aux erreurs et de la génétique inverse. La méthode fournit un modèle pour la sélection phénotypique et peut être utilisée pour les génomes de virus à ARN à sens positif de 10 kb de long.

Abstract

L’absence d’une méthode pratique pour la génération itérative de divers variants viraux pleine longueur a entravé l’étude de l’évolution dirigée dans les virus à ARN. En intégrant une PCR complète du génome de l’ARN sujette aux erreurs et une génétique inverse, une mutagénèse de substitution aléatoire à l’échelle du génome peut être induite. Nous avons développé une méthode utilisant cette technique pour synthétiser diverses banques afin d’identifier des mutants viraux avec des phénotypes d’intérêt. Cette méthode, appelée synthèse d’ARN mutant pleine longueur (FL-MRS), offre les avantages suivants : (i) la possibilité de créer une grande bibliothèque via une PCR très efficace en une seule étape sujette aux erreurs ; (ii) la capacité de créer des groupes de banques avec différents niveaux de diversité génétique en manipulant la fidélité de l’ADN polymérase ; (iii) la création d’un produit de PCR complet pouvant directement servir de modèle pour la synthèse d’ARN mutant ; et (iv) la capacité de créer de l’ARN qui peut être délivré dans les cellules hôtes en tant que pool d’entrée non sélectionné pour dépister les mutants viraux du phénotype souhaité. Nous avons constaté, à l’aide d’une approche de génétique inverse, que la FL-MRS est un outil fiable pour étudier l’évolution dirigée par le virus à tous les stades du cycle de vie de l’isolat JFH1 du virus de l’hépatite C. Cette technique semble être un outil inestimable pour utiliser l’évolution dirigée afin de comprendre l’adaptation, la réplication et le rôle des gènes viraux dans la pathogenèse et la résistance aux antiviraux chez les virus à ARN de sens positif.

Introduction

Le criblage génétique direct commence par un phénotype viral d’intérêt, puis, en séquençant son génome et en le comparant à celui de la souche d’origine, tente d’identifier la ou les mutations à l’origine de ce phénotype. En revanche, dans les criblages génétiques inversés, des mutations aléatoires sont introduites dans un gène cible, suivies d’un examen du ou des phénotypes résultants1^. Pour l’approche de la génétique inverse, la mutagénèse in vitro est la technique la plus largement utilisée pour créer un pool de variants qui sont ensuite criblés pour les phénotypes d’intérêt. Divers outils génétiques ont été rapportés pour réaliser la mutagénèse aléatoire à l’échelle du génome des virus à ARN, y compris la PCR sujette aux erreurs (ep-PCR)^2,3, l’extension circulaire de la polymérase⁴ et la mutagénèse par insertion de mu-transposons 5,6,7. Ces deux dernières méthodes permettent d’obtenir des bibliothèques abritant une diversité de séquences limitée et sont sujettes à l’introduction d’insertions et de délétions importantes, qui sont hautement létales pour les virus et limitent considérablement la récupération des variants viraux infectieux.

L’ep-PCR est une technique de mutagenèse puissante bien connue largement utilisée dans l’ingénierie des protéines pour générer des enzymes mutantes pour la sélection de phénotypes ayant les propriétés souhaitées, telles qu’une stabilité thermique améliorée, une spécificité du substrat et une activité catalytique 8,9,10. Cette technique est facile à réaliser car elle nécessite un équipement simple, n’implique pas de manipulations fastidieuses, utilise des réactifs disponibles dans le commerce et est rapide ; De plus, il génère des bibliothèques de haute qualité.

Ici, nous avons développé une nouvelle méthode de synthèse d’ARN mutant pleine longueur (FL-MRS) pour générer des génomes complets du virus de l’hépatite C (VHC) en intégrant l’ep-PCR, qui induit une mutagenèse de substitution aléatoire à l’échelle du génome et une génétique inverse. Même l’insertion ou la délétion d’un seul nucléotide est très délétère pour les virus à ARN à sens positif ([+]ssRNA) ; par conséquent, la mutagenèse de substitution basée sur la PCR est la méthode préférée pour la génération itérative de grandes banques diversifiées de génomes complets de virus à ARN (+)ss avec une bonne viabilité.

FL-MRS est une approche simple qui peut être appliquée à n’importe quel virus à ARN de sens positif avec une longueur de génome de ~10 kb grâce à la conception méticuleuse d’un ensemble d’amorces qui se lie au clone d’ADNc viral. pJFH1 est un clone d’ADNc infectieux qui code pour le génotype 2a du VHC et peut récapituler toutes les étapes du cycle de vie du virus. En utilisant l’approche FL-MRS, nous avons démontré la synthèse de banques de génomes complets mutagènes aléatoirement (banques de mutants [MLs]) pour produire des variants de JFH1 compétents pour la réplication pour lesquels il n’y avait aucune connaissance préalable des propriétés associées aux mutations. Lors de l’exposition à un antiviral, certaines des variantes virales ont rapidement surmonté la pression du médicament avec le changement phénotypique souhaité. En utilisant le protocole décrit ici, une pléthore de variants viraux peuvent être générés, créant des opportunités pour étudier l’évolution des virus à (+)ARNss.

Protocol

REMARQUE : La souche JFH1 (WT) utilisée ici est un cadeau de Takaji Wakita, de l’Institut national des maladies infectieuses. La lignée cellulaire de l’hépatome humain, Huh7.5, était un cadeau de Charles Rice, de l’Université Rockefeller. Un schéma de la méthode est présenté à la figure 1. 1. Mutagénèse par substitution pangénomique de JFH1 à l’aide de la PCR sujette aux erreurs Pour réaliser l’ep-PCR, préparer …

Representative Results

Une pléthore de variants complets du VHC peuvent être générés et dépistés pour les phénotypes résistants aux médicaments d’intérêt en suivant les procédures décrites à la figure 1. Des banques de mutants du génome complet ont été synthétisées à l’aide de clonal-pJFH1 en quantités décroissantes (100-10 ng), comme le montre la figure 2. Les rendements moyens des produits ep-PCR (banques de mutants) variaient de 3,8 à 12,5 ng/μL. <stron…

Discussion

Dans cette étude, nous avons détaillé une procédure simple et rapide de FL-MRS qui intègre l’ep-PCR¹⁸ et la génétique inverse pour synthétiser des banques de génomes complets du VHC, qui peuvent ensuite être utilisées dans un système de culture cellulaire pour générer des variants compétents en réplication pour le criblage de phénotypes résistants aux médicaments. L’utilisation de l’ADN polymérase Taq basse fidélité est une condition préalable à l’ep-PCR qui permet …

Materials

1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 – 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S