גנטיקה הפוכה כדי להנדס וריאנטים של נגיף RNA בעל חוש חיובי
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה להחדרת מגוון גנטי נשלט בגנום נגיף הפטיטיס C על ידי שילוב סינתזת RNA מוטנטית באורך מלא באמצעות PCR נוטה לשגיאות וגנטיקה הפוכה. השיטה מספקת מודל לבחירת פנוטיפ וניתן להשתמש בה עבור גנומים ארוכים של 10 קילובייט של נגיף RNA בעל חוש חיובי.
Abstract
היעדר שיטה נוחה ליצירה איטרטיבית של גרסאות ויראליות מגוונות באורך מלא פגע בחקר האבולוציה המכוונת בנגיפי RNA. על ידי שילוב של PCR גנום RNA מלא הנוטה לטעויות וגנטיקה הפוכה, ניתן לגרום למוטגנזה של החלפה אקראית בכל הגנום. פיתחנו שיטה המשתמשת בטכניקה זו כדי לסנתז ספריות מגוונות כדי לזהות מוטנטים נגיפיים עם פנוטיפים מעניינים. שיטה זו, הנקראת סינתזת RNA מוטנטי באורך מלא (FL-MRS), מציעה את היתרונות הבאים: (i) היכולת ליצור ספרייה גדולה באמצעות PCR יעיל ביותר הנוטה לשגיאות בשלב אחד; (ii) היכולת ליצור קבוצות של ספריות עם רמות שונות של מגוון גנטי על ידי מניפולציה של נאמנות DNA פולימראז; (iii) יצירת מוצר PCR באורך מלא שיכול לשמש ישירות כתבנית לסינתזה של RNA מוטנטי; ו-(iv) היכולת ליצור RNA שיכול להיות מועבר לתאים מארחים כמאגר קלט שלא נבחר כדי לסנן מוטציות נגיפיות של הפנוטיפ הרצוי. מצאנו, תוך שימוש בגישה גנטית הפוכה, כי FL-MRS הוא כלי אמין לחקר אבולוציה מכוונת נגיפים בכל שלבי מחזור החיים של נגיף הפטיטיס C, JFH1 מבודד. נראה כי טכניקה זו היא כלי רב ערך לשימוש באבולוציה מכוונת כדי להבין הסתגלות, שכפול ותפקידם של גנים נגיפיים בפתוגנזה ועמידות אנטי-ויראלית בנגיפי RNA בעלי חוש חיובי.
Introduction
סינון גנטי מתקדם מתחיל בפנוטיפ ויראלי מעניין ולאחר מכן, באמצעות ריצוף הגנום שלו והשוואתו לזה של הזן המקורי, מנסה לזהות את המוטציה (ים) הגורמת לפנוטיפ זה. לעומת זאת, במסכים גנטיים הפוכים, מוטציות אקראיות מוצגות בגן המטרה, ולאחר מכן בדיקה של הפנוטיפ(ים)1 המתקבלים. עבור הגישה הגנטית ההפוכה, מוטגנזה במבחנה היא הטכניקה הנפוצה ביותר ליצירת מאגר של וריאנטים אשר לאחר מכן מוקרן עבור פנוטיפים של עניין. כלים גנטיים שונים דווחו להשגת מוטגנזה אקראית כלל-גנומית של נגיפי RNA, כולל PCR נוטה לשגיאות (ep-PCR)2,3, הרחבת פולימראז מעגלית4, ומוטגנזה החדרת Mu-transposon 5,6,7. שתי השיטות האחרונות מניבות ספריות בעלות מגוון רצפים מוגבל ומועדות להכנסת החדרות ומחיקות גדולות, שהן קטלניות מאוד לנגיפים ומגבילות מאוד את ההתאוששות של וריאנטים נגיפיים זיהומיים.
ep-PCR היא טכניקת מוטגנזה חזקה ידועה הנמצאת בשימוש נרחב בהנדסת חלבונים ליצירת אנזימים מוטנטיים לבחירת פנוטיפים בעלי תכונות רצויות, כגון יציבות תרמית משופרת, ספציפיות המצע ופעילות קטליטית 8,9,10. טכניקה זו קלה לביצוע מכיוון שהיא דורשת ציוד פשוט, אינה כרוכה במניפולציות מייגעות, משתמשת בריאגנטים זמינים מסחרית והיא מהירה; יתר על כן, הוא מייצר ספריות באיכות גבוהה.
כאן, פיתחנו שיטה חדשנית לסינתזה של RNA מוטנטי באורך מלא (FL-MRS) ליצירת גנומים שלמים של נגיף הפטיטיס C (HCV) על ידי שילוב ep-PCR, אשר גורם למוטגנזה חלופית אקראית בכל הגנום וגנטיקה הפוכה. אפילו החדרה או מחיקה של נוקלאוטידים בודדים מזיקה מאוד לנגיפי RNA בעלי חוש חיובי ([+]ssRNA); לפיכך, מוטגנזה חלופית מבוססת PCR היא השיטה המועדפת ליצירה איטרטיבית של ספריות גדולות ומגוונות של גנומים מלאים (+)ss RNA virus עם כדאיות טובה.
FL-MRS היא גישה פשוטה שניתן ליישם על כל וירוס RNA בעל חוש חיובי עם אורך גנום ~ 10 kb באמצעות תכנון קפדני של ערכת פריימר שנקשרת לשיבוט cDNA נגיפי. pJFH1 הוא שיבוט cDNA מדבק המקודד את גנוטיפ HCV 2a ויכול לשחזר את כל שלבי מחזור החיים של הנגיף. על ידי שימוש בגישת FL-MRS, הדגמנו את הסינתזה של ספריות גנום מלא מוטגניות אקראיות (ספריות מוטנטיות [MLs]) כדי לייצר גרסאות JFH1 כשירות לשכפול שלגביהן לא היה ידע מוקדם על התכונות הקשורות למוטציות. עם החשיפה לתרופה אנטי-ויראלית, חלק מהווריאנטים הנגיפיים התגברו במהירות על לחץ התרופה עם השינוי הפנוטיפי הרצוי. באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, ניתן ליצור שפע של וריאנטים נגיפיים, היוצרים הזדמנויות לחקור את האבולוציה של (+)נגיפי ssRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, פירטנו הליך FL-MRS פשוט ומהיר המשלב ep-PCR18 וגנטיקה הפוכה לסינתזה של ספריות HCV בגנום מלא, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהן במערכת תרבית תאים כדי ליצור וריאנטים בעלי יכולת שכפול לסינון פנוטיפים עמידים לתרופות. השימוש ב- Taq DNA polymerase בנאמנות נמוכה הוא תנאי מוקדם של ep-PCR המאפשר שילוב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה במימון (מספר מענק BT/PR10906/MED/29/860/2014) למחקר זה ניתנה על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו.
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -. J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
