Genética reversa para projetar variantes do vírus de RNA de sentido positivo

Summary

O protocolo descreve um método para introduzir diversidade genética controlável no genoma do vírus da hepatite C combinando síntese completa de RNA mutante usando PCR propenso a erros e genética reversa. O método fornece um modelo para seleção de fenótipos e pode ser usado para genomas de vírus de RNA de sentido positivo de 10 kb longos.

Abstract

A falta de um método conveniente para a geração iterativa de diversas variantes virais de comprimento total tem impedido o estudo da evolução dirigida em vírus de RNA. Ao integrar uma PCR propensa a erros no genoma de RNA e genética reversa, a mutagênese de substituição aleatória do genoma pode ser induzida. Desenvolvemos um método usando esta técnica para sintetizar diversas bibliotecas para identificar mutantes virais com fenótipos de interesse. Esse método, chamado síntese completa de RNA mutante (FL-MRS), oferece as seguintes vantagens: (i) a capacidade de criar uma grande biblioteca por meio de uma PCR altamente eficiente e propensa a erros em uma etapa; (ii) a capacidade de criar grupos de bibliotecas com diferentes níveis de diversidade genética, manipulando a fidelidade da DNA polimerase; (iii) a criação de um produto de PCR completo que possa servir diretamente como um modelo para a síntese de RNA mutante; e (iv) a capacidade de criar RNA que pode ser entregue em células hospedeiras como um pool de entrada não selecionado para rastrear mutantes virais do fenótipo desejado. Descobrimos, usando uma abordagem de genética reversa, que a ERM-FL é uma ferramenta confiável para estudar a evolução dirigida por vírus em todos os estágios do ciclo de vida do vírus da hepatite C, isolado de JFH1. Esta técnica parece ser uma ferramenta inestimável para empregar a evolução dirigida para entender a adaptação, a replicação e o papel dos genes virais na patogênese e resistência antiviral em vírus de RNA de sentido positivo.

Introduction

O rastreamento genético antecipado começa com um fenótipo viral de interesse e, em seguida, por meio do sequenciamento de seu genoma e comparação com o da cepa original, tenta identificar a(s) mutação(ões) causadora(s) desse fenótipo. Em contraste, nos rastreamentos genéticos reversos, mutações aleatórias são introduzidas em um gene alvo, seguidas por um exame do(s) fenótipo(s) resultante(s)¹. Para a abordagem da genética reversa, a mutagênese in vitro é a técnica mais amplamente utilizada para criar um pool de variantes que são posteriormente rastreadas para fenótipos de interesse. Várias ferramentas genéticas têm sido relatadas para a obtenção de mutagênese aleatória genômica de vírus de RNA, incluindo PCR propenso a erros (ep-PCR)^2,3, extensão circular da polimerase⁴ e mutagênese de inserção Mu-transposon 5,6,7. Os dois últimos métodos produzem bibliotecas com diversidade limitada de sequências e são propensos à introdução de grandes inserções e deleções, que são altamente letais para vírus e limitam severamente a recuperação de variantes virais infecciosas.

A EP-PCR é uma conhecida e poderosa técnica de mutagênese amplamente utilizada na engenharia de proteínas para gerar enzimas mutantes para a seleção de fenótipos com propriedades desejadas, tais como maior estabilidade térmica, especificidade do substrato e atividade catalítica 8,9,10. Esta técnica é de fácil execução, pois requer equipamentos simples, não envolve manipulações tediosas, utiliza reagentes disponíveis comercialmente e é rápida; Além disso, gera bibliotecas de alta qualidade.

Aqui, desenvolvemos um novo método para síntese completa de RNA mutante (FL-MRS) para gerar genomas completos do vírus da hepatite C (HCV) através da integração de ep-PCR, que induz mutagênese de substituição aleatória do genoma e genética reversa. Mesmo uma inserção ou deleção de nucleotídeo único é altamente deletéria para vírus de RNA de sentido positivo ([+]ssRNA); portanto, a mutagênese de substituição baseada em PCR é o método preferido para a geração iterativa de grandes e diversas bibliotecas de genomas completos de RNA (+)ss com boa viabilidade.

FL-MRS é uma abordagem direta que pode ser aplicada a qualquer vírus de RNA de sentido positivo com um comprimento de genoma de ~10 kb através do design meticuloso de um conjunto de primers que se liga ao clone de cDNA viral. pJFH1 é um clone de cDNA infeccioso que codifica o genótipo 2a do HCV e pode recapitular todas as etapas do ciclo de vida do vírus. Usando a abordagem da FL-MRS, demonstramos a síntese de bibliotecas do genoma completo mutagenizadas aleatoriamente (bibliotecas mutantes [MLs]) para produzir variantes JFH1 competentes em replicação para as quais não havia conhecimento prévio das propriedades associadas às mutações. Após a exposição a um antiviral, algumas das variantes virais rapidamente superaram a pressão medicamentosa com a mudança fenotípica desejada. Usando o protocolo descrito aqui, uma infinidade de variantes virais pode ser gerada, criando oportunidades para estudar a evolução dos vírus (+)ssRNA.

Protocol

NOTA: A cepa JFH1 (WT) usada aqui foi um presente gentil de Takaji Wakita, Instituto Nacional de Doenças Infecciosas. A linhagem celular de hepatoma humano, Huh7.5, foi um presente gentil de Charles Rice, da Universidade Rockefeller. Um esquema do método é mostrado na Figura 1. 1. Mutagênese de substituição genômica ampla de JFH1 usando PCR propenso a erros Para a realização da ep-PCR, preparar a mistura mestre para quatro conju…

Representative Results

Uma infinidade de variantes completas do HCV pode ser gerada e rastreada para fenótipos resistentes de interesse seguindo os procedimentos descritos na Figura 1. Bibliotecas completas de mutantes do genoma foram sintetizadas usando clonal-pJFH1 em quantidades decrescentes (100-10 ng), como mostrado na Figura 2. Os rendimentos médios dos produtos de ep-PCR (bibliotecas mutantes) variaram de 3,8-12,5 ng/μL. A Figura 3 mostra os tra…

Discussion

Neste estudo, detalhamos um procedimento simples e rápido de FL-MRS que integra ep-PCR¹⁸ e genética reversa para sintetizar bibliotecas do genoma completo do HCV, que pode então ser usado em um sistema de cultura celular para gerar variantes competentes em replicação para a triagem de fenótipos resistentes a drogas. O uso de Taq DNA polimerase de baixa fidelidade é um pré-requisito da ep-PCR que permite a incorporação de substituições durante a amplificação por PCR de um genoma viral…

Materials

1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 – 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S