Studere Murine Small Bowel Mechanosensing av Luminal partikler

Summary

For å studere hvordan tynntarmen håndterer partikler av varierende størrelse, har vi modifisert en etablert in vivo-metode for å bestemme tynntarmstransittrasjon.

Abstract

Gastrointestinal (GI) motilitet er kritisk for normal fordøyelse og absorpsjon. I tynntarmen, som absorberer næringsstoffer, optimaliserer motilitet fordøyelsen og absorpsjonen. Av denne grunn inkluderer noen av motilitetsmønstrene i tynntarmen segmentering for blanding av luminalinnhold og peristaltikk for fremdrift. Fysiske egenskaper av luminalinnhold modulerer mønstrene av tynntarmmotilitet. Den mekaniske stimuleringen av GI-mekanosensoriske kretser ved å overføre luminalinnhold og underliggende tarmmotilitet initierer og modulerer komplekse GI-motormønstre. Likevel forblir de mekanosensoriske mekanismene som driver denne prosessen dårlig forstått. Dette skyldes først og fremst mangel på verktøy for å dissekere hvordan tynntarmen håndterer materialer med forskjellige fysiske egenskaper. For å studere hvordan tynntarmen håndterer partikler av varierende størrelse, har vi modifisert en etablert in vivo-metode for å bestemme tynntarmstransittrasjon. Vi gavage levende mus med fluorescerende væske eller små fluorescerende perler. Etter 30 minutter dissekerer vi tarmene for å avbilde fordelingen av fluorescerende innhold over hele GI-kanalen. I tillegg til høyoppløselige målinger av det geometriske senteret, bruker vi binning med variabel størrelse og spektralanalyse for å bestemme hvordan forskjellige materialer påvirker tynntarmstransittrasjonen. Vi har undersøkt hvordan en nylig oppdaget “gut touch” -mekanisme påvirker tynntarmmotilitet ved hjelp av denne tilnærmingen.

Introduction

Den menneskelige gastrointestinale (GI) kanalen er et flere fot langt organsystem, omtrent tilnærmet som et rør av varierende dimensjoner og fysiske egenskaper¹. Når innholdet beveger seg gjennom lengden, er GI-kanalens primære funksjon å absorbere stoffer som er kritiske for livet. Tynntarmen er spesielt ansvarlig for næringsopptak. Tynntarmens transitt er tett regulert for å matche fordøyelses- og absorpsjonsfunksjonene, noe som resulterer i forskjellige motilitetsmønstre. Bayliss og Starling beskrev “tarmens lov”² i 1899, og viste det kontraktile fremdriftsprogrammet i tarmen kjent i dag som den peristaltiske refleksen; segmentet proksimalt for matbolusen trekker seg sammen for å drive den fremover, og det distale segmentet slapper av for å motta det. I teorien kan dette mønsteret alene være tilstrekkelig til å transportere materiale aboralt, men over et århundre med forskning har malt et mer komplekst bilde av kontraktil aktivitet i GI-kanalen. Tre tynntarmmotilitetsperioder er anerkjent hos mennesker: det migrerende motorkomplekset (MMC), fasteperioden og den postprandiale perioden³. De samme mønstrene er rapportert hos mus ^4,5. MMC er et syklisk motormønster som er bevart over de fleste pattedyr ^6,7. MMC har et karakteristisk firefasemønster som fungerer som en nyttig klinisk markør ved funksjonelle GI-lidelser⁷. De fire fasene, i rekkefølge av forekomst, er (I) hvile, (II) uregelmessige, lave amplitudekontraksjoner, (III) regelmessige sammentrekninger med høy amplitude og (IV) nedtrappingsperiode med fallende aktivitet⁷. MMC markerer det viktigste motormønsteret i fasteperioden³. MMC i fasteperioden rydder opp innholdet i tynntarmen som forberedelse til neste måltid.

Motormønstrene i postprandialperioden er optimalisert for fordøyelses- og absorberende funksjoner³. Uavhengig av kalorisammensetning er den første transitten rask langs tynntarmen, innholdet spres langs tarmens lengde, og transitt bremser deretter⁸. Absorpsjon optimaliseres ved å øke kontaktflaten og bremse den ned for å øke oppholdstiden. Når næringsstoffene er inne i lumen, består det dominerende mønsteret av nære (<2 cm fra hverandre) ukoordinerte sammentrekninger (segmenteringskontraksjoner), med noen få overliggende store amplitudekontraksjoner som spenner over hele tynntarmens lengde (peristaltiske sammentrekninger)⁹. Segmenteringskontraksjoner blander det intraluminale innholdet på plass. De sporadiske store peristaltiske sammentrekningene driver innholdet mot tykktarmen.

Tidspunktet for denne overgangen tilbake til MMC avhenger av matvolum og kalorisammensetning¹⁰. Dermed er tynntarmprøvene luminale signaler for å regulere når man skal overgang mellom motilitetsperioder. Mekaniske signaler, for eksempel fysiske egenskaper til luminalinnhold¹¹, luminalvolum og veggspenning, engasjerer mekanoreceptorceller i GI-veggen 12,13,14,15,16. Å øke den faste komponenten i et måltid fører faktisk til en økning i tynntarmstransitt¹⁷. Vi spekulerer i at fysiske egenskaper, som flytende eller fast tilstand av intraluminal innhold, må engasjere forskjellige mekanoreceptorer på grunn av de forskjellige kreftene de genererer på GI-veggen¹⁸.

Gullstandarden for måling in vivo GI-transitt hos mennesker, som hos mus, er bruk av radioaktive sporstoffer målt ved scintigrafi når de går ut av magen eller passerer langs tykktarmen^19,20. Hos pattedyr sløyfer tynntarmen på uforutsigbare måter som gjør tynntarmen vanskelig å avbilde in vivo pålitelig, men det gjøres fremskritt²¹. Videre mangler det i dag verktøy for å kvantifisere hvordan tynntarmen håndterer partikler av varierende egenskaper og størrelser. Utgangspunktet her var en gullstandardteknikk som standardiserer studiet av tynntarmstransitt 22,23,24 og barrierefunksjon ²². Den består av gavaging mus med et fluorescerende materiale, venter på GI-motilitet for å transportere materialet, excising GI-kanalen, segmentering i flere seksjoner fra mage til tykktarm, seksjonering og homogenisering av intraluminal innhold for fluorescenskvantifisering. Vi gjorde to forbedringer. Først endret vi sammensetningen av gavaged innholdet for å inkludere fluorescerende mikroskopiske perler for å bestemme hvordan tynntarmen fordeler fysiske partikler. For det andre forbedret vi den romlige oppløsningen ved å avbilde hele GI-kanalen fra mage til kolon ex vivo og brukte binning med variabel størrelse for å standardisere analysen vår på tvers av dyr. Vi postulerer at dette avslører ny innsikt i balansen mellom propulsive versus segmenterende sammentrekninger i postprandialfasen.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Mayo Clinic. 1. Oppsett Raske 8- til 10 uker gamle mus i 4 timer. Gi mus tilgang til vann.MERK: Vi bruker villtype mannlige C57BL / 6J-mus for alle eksperimenter som presenteres her, men de kan utføres på mus av hvilken som helst stamme, kjønn og genotype. Avkjøl 15 ml destillert vann i et 50 ml konisk rør i et 4 °C kjøleskap. Varm ytterlig…

Representative Results

Vi viser representative resultater fra trinn 3 og utover. Figur 1 viser intakte eksplanterte tarmer, med fluorescerende målinger overlagt. Magesekken (lilla) legges langs samme akse som tynntarmen (oransje), men vi foretrekker å flytte cecum (blå) til siden for å hindre overlapping med tykktarmen (oransje). Som det fremgår av venstre panel, er dette ikke alltid mulig på grunn av organstørrelse. Vi kutter tynntarmen på ~ 200 mm for å maksimere dekningen av kontinuerlige segmenter, me…

Discussion

GI-kanalen, som andre rørformede organer, som blodkar, krever mekaniske sensorer og effektorer for å opprettholde homeostase^26,27,28. Imidlertid er GI-kanalen unik ved at de fysiske egenskapene til materialene som krysser den ikke er konstante over måltider. Intraluminal innhold av forskjellige fysiske egenskaper (fast, flytende og gass) passerer tarmen, genererer forskjellige mekaniske innganger til GI-mekanoreceptorene. Fak…

Materials

C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	664	other mice can be used with this protocol
Dissection tools	n/a	n/a
Excel software	Microsoft	n/a	used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um – 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 75-90um – 10g	"smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um – 10g	Cospheric	UVPMS-BG-1.00 180-212um – 10g	"larger beads" in the manuscript
Gavage needles	Instech	FTP-18-50-50
ImageJ software	n/a	n/a	used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house)	n/a	n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP)	Sigma	M0262
Photoshop software	Adobe	n/a	used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran	Sigma	r8881-100mg	"liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system