Визуализация подвижности бактерий на основе цветовой реакции
Summary
Здесь мы представляем протокол для обнаружения бактериальной подвижности, основанный на цветовой реакции. Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он прост в оценке и более точен, и не требует специализированного оборудования.
Abstract
Подвижность бактерий имеет решающее значение для патогенности бактерий, образования биопленки и лекарственной устойчивости. Подвижность бактерий имеет решающее значение для инвазии и/или распространения многих патогенных видов. Поэтому важно выявлять бактериальную подвижность. Условия роста бактерий, такие как кислород, рН и температура, могут влиять на рост бактерий и экспрессию бактериальных жгутиков. Это может привести к снижению подвижности или даже потере подвижности, что приводит к неточной оценке подвижности бактерий. Основываясь на цветовой реакции 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС) внутриклеточными дегидрогеназами живых бактерий, ТТС добавляли к традиционному полутвердому агару для определения подвижности бактерий. Результаты показали, что этот метод обнаружения подвижности бактерий с полутвердым агаром TTC прост, удобен в эксплуатации и не требует больших и дорогостоящих инструментов. Результаты также показали, что наибольшая подвижность наблюдалась в полутвердой среде, приготовленной с 0,3% агара. По сравнению с традиционной полутвердой средой результаты легче оценить и они более точны.
Introduction
Подвижность бактерий играет решающую роль в патогенности бактерий, образовании биопленки и лекарственной устойчивости1. Бактериальная подвижность тесно связана с патогенностью и необходима для колонизации бактерий во время раннего инфицирования клеток-хозяев2. Образование биопленки тесно связано с подвижностью бактерий, когда бактерии прилипают к поверхности твердой среды за счет подвижности. Долгое время считалось, что подвижность бактерий положительно коррелирует с образованием биопленки. Высокая степень бактериальной лекарственной устойчивости из-за биопленки может привести к персистирующим инфекциям, представляющим угрозу для здоровья человека 3,4,5. Поэтому важно выявлять бактериальную подвижность. Тест на подвижность бактерий в основном используется для изучения подвижности различных форм бактерий в живом состоянии, которые могут косвенно определять наличие или отсутствие жгутиков и, таким образом, играют важную роль в идентификации бактерий.
Различают прямые и непрямые методы выявления бактериальной подвижности6. Поскольку бактерии со жгутиками проявляют подвижность, можно определить, являются ли бактерии подвижными косвенно, обнаружив наличие или отсутствие жгутиков. Например, можно косвенно обнаружить подвижность с помощью электронной микроскопии и окрашивания жгутиков, чтобы указать, что бактерии подвижны. Также возможно обнаружение прямыми методами, такими как капля суспензии и полутвердая пункция.
Метод полутвердой пункции, обычно используемый в микробиологических лабораториях бакалавриата для обнаружения подвижности бактерий, инокулирует бактерии в прокол в полутвердой агаровой среде, содержащей 0,4-0,8% агара, в зависимости от направления роста бактерий. Если бактерии растут вдоль линии прокола, чтобы распространиться вокруг, появляются облачные (кистевидные) следы роста, указывающие на наличие жгутиков и, следовательно, подвижность. Если нет следов роста на линии прокола, бактерия не является ни жгутиковой, ни подвижной.
Однако у этого метода есть свои недостатки: бактерии бесцветны и прозрачны, на жгутиковую активность влияют физиологические особенности живых бактерий и другие факторы, а также концентрация агара и малый диаметр пробирки. Более того, аэробные бактерии пригодны только для роста на поверхности агара, влияя на наблюдение за подвижностью бактерий. Следовательно, для улучшения этого эксперимента в среду был добавлен 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (TTC) (бесцветный), чтобы установить более надежный и интуитивно понятный метод определения подвижности бактерий, чем текущий метод прямой пункции с использованием внутриклеточных дегидрогеназ для катализа образования красного продукта TTC 7,8,9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
На выявление подвижности бактерий методом полутвердой среды влияет множество факторов13,14. Условия роста бактерий, такие как кислород (аэробный на поверхности агара, неаэробный на дне пробирки с полутвердой средой), рН и температура, могут влиять на жизне…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD) и Исследовательским проектом по реформе преподавания Китайского фармацевтического университета (2019XJYB18).
Materials
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. Bacterial motility. Journal of Bacteriology. 27 (2), 165 (1934).
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria – A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. . Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W. Improved motility medium. Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
