Småskalig extraktion av Caenorhabditis elegans Genomiskt DNA

Summary

Här presenteras en beskrivning av den enkla och relativt snabba isoleringen av Caenorhabditis elegans genomiskt DNA från ett eller ett fåtal djur med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt vävnadskit. Den resulterande gDNA-beredningen är en lämplig mall för PCR.

Abstract

Genomisk DNA-extraktion från enstaka eller några Caenorhabditis elegans har många nedströmsapplikationer, inklusive PCR för genotypningslinjer, kloning och sekvensering. De traditionella proteinas K-baserade metoderna för genomisk DNA-extraktion från C. elegans tar flera timmar. Kommersiella extraktionssatser som effektivt bryter upp C. elegans-nagelbandet och extraherar genomiskt DNA är begränsade. En enkel, snabbare (~ 15 min) och kostnadseffektiv metod för att extrahera C. elegans genomiskt DNA som fungerar bra för klassrums- och forskningsapplikationer rapporteras här. Denna DNA-extraktionsmetod är optimerad för att använda enstaka eller några få sena larver (L4) eller vuxna nematoder som utgångsmaterial för att få en pålitlig mall för att utföra PCR. Resultaten indikerar att DNA-kvaliteten är lämplig för att förstärka genmål av olika storlekar med PCR, vilket möjliggör genotypning av enstaka eller några djur även vid utspädningar till en femtiondel av det genomiska DNA från en enda vuxen per reaktion. De rapporterade protokollen kan på ett tillförlitligt sätt användas för att snabbt producera DNA-mall från ett enda eller ett litet prov av C. elegans för PCR-baserade applikationer.

Introduction

Här presenteras två relaterade protokoll för lysning av Caenorhabditis elegans för att göra DNA tillgängligt för PCR-baserade applikationer. PCR är en vanlig molekylär teknik som används för många applikationer, inklusive genotypning och förstärkning av DNA-fragment för kloning och sekvensering, bland andra. Den lilla (1 mm), frilevande rundmasken C. elegans är ett populärt djursystem för biologisk forskning. Att erhålla lämpligt genomiskt DNA från ett enda djur eller några djur är tillräckligt för att förstärka sekvensen med PCR. Sena L4-larver och vuxna innehåller endast ~ 1 000 somatiska celler (inklusive vissa multinukleära, polyploida celler), bakterieceller och (om djuret är en gravid hermafrodit) avkomma i utero¹. Dessa djur skyddas dock av en nagelband som måste störas för att extrahera det genomiska DNA². Standardmetoder för att förbereda nematodgenomisk DNA-mall för PCR involverar flera steg och tar flera timmar. Djuren fryses först i masklysbuffert som innehåller proteinas K (−70 °C eller lägre) i minst 15–45 minuter (längre rekommenderas enligt vissa protokoll)3,4,5,6. Detta steg sprickor öppnar djuren.

Efter frysning inkuberas djuren i 1 timme vid 60-65 °C för att proteinaset K ska fungera, sedan inaktiveras enzymet i 15-30 minuter vid 95 °C. Proteinaset K förstör nukleaserna som bryter ner DNA. Inaktiveringen av proteinas K före PCR är viktig för att förhindra att proteinaset K bryter ner DNA-polymeraset. De två kitbaserade protokollen som beskrivs här är snabba, pålitliga och kostnadseffektiva metoder för att extrahera genomiskt DNA från antingen ett enda djur eller några nematoder för daglig forskning och undervisning i laboratorieapplikationer. Satsen som användes optimerades ursprungligen av tillverkaren för att extrahera DNA från djurvävnad, saliv och hår⁷. Den använder en proprietär vävnadsberedningslösning och extraktionslösning för att lysera celler och göra genomiskt DNA tillgängligt. En proprietär neutraliseringslösning neutraliserar sedan de komponenter som kan hämma PCR (t.ex. salter, joner och Mg²⁺-bindande molekyler).

Vid genotypning kan ett enda djur testas. Vid bestämning av om en stam är homozygot ger testning av sex eller fler avkommor från ett enda djur högt förtroende för att en linje är homozygot eller inte (det finns en 0,02% chans att slumpmässigt välja sex homozygota mutanta avkommor från en heterozygot förälder [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Denna metod 1) är enkel, med färre steg än proteinas K-metoden, och 2) minskar mallberedningstiden till 15 min. Resultaten i detta arbete visar att det utvecklade protokollet fungerar robust för att extrahera genomiskt DNA från enstaka eller några maskar, vilket på ett tillförlitligt sätt kan användas för nedströmsapplikationer som inte kräver högrenat DNA, inklusive PCR.

Protocol

1. C. elegans underhåll OBS: N2 (vild typ) och blmp-1 (tm548) C. elegans stammar bibehölls på standardplattor för nematodtillväxtmedier (NGM) vid 20 °C. Förbered NGM-plattorna genom att lösa upp 23 005 g NGM-pulver i 973 ml vatten i en 2-liters kolv. Täck kolvöppningen med aluminiumfolie (eller autoklaverbart lock som möjliggör avluftning) och säkra beläggningen med autoklavtejp. Autoklav för att lösa upp pulvret och sterilisera inne…

Representative Results

Genomiskt DNA från en enda eller några vuxna av vild typ extraherades med hjälp av det kommersiella kitet eller det traditionella lysprotokollet för att jämföra effekten av dessa två metoder. Dessa lysater användes sedan som mallar för PCR för att förstärka antingen ett större mål på ~ 2 100 bp (kodning av blmp-1) eller ett mindre mål på ~ 500 bp (kodning av en del av sma-10). Båda metoderna gav framgångsrikt lämpliga PCR-produkter (figur 1A). <p cla…

Discussion

Att bestämma genotyperna av C. elegans är ett viktigt steg när man utför genetiska korsningar för att skapa nya C. elegans-stammar . Genomisk DNA-extraktion med hjälp av en enda eller få C. elegans är ett avgörande steg för att genotypa C. elegans. Detta protokoll beskriver genomisk DNA-extraktion från C. elegans med hjälp av ett kommersiellt kit. Denna metod är snabb och fungerar robust. Det genomiska DNA som extraheras med denna metod kan användas för nedströ…

Materials

autoclave tape	Defend	43237-2
aluminium foil, heavy duty	Reynolds Wrap	2182934
calcium chloride	Millipore Sigma	102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution)	Sigma-Aldrich Co. LLC	XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer	Fisher Scientific	11-100-495H
LB media, Lennox, capsules	MP Biomedicals, LLC	3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous	Thermo Scientific	AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge	Labnet International, Inc.	PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs, Inc.	M0515S	"Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder	US Biological Life Sciences	N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs, Inc.	M0531S	"Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers	Integrated DNA Technologies	custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase	Takara Bio Inc.	R050B	"Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb)	New England Biolabs, Inc.	N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix	Takara Bio Inc.	RR350A	"Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix	Sigma-Aldrich Co. LLC	P4600	"Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24812
stir bar	Fisher Scientific	14-512-126
vortex mixer	Fisher Scientific	2215365
worm pick	Genesee Scientific Corporation	59-AWP