Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Camille M. Selvais; Laura L. De Cock; Sonia M. Brichard; Mar&#237;a A. Davis-L&#243;pez de Carrizosa

doi:10.3791/63718

JoVE Journal > Medicine

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의학

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

Published: June 08, 2022

doi:

10.3791/63718

Camille M. Selvais, Laura L. De Cock, Sonia M. Brichard, María A. Davis-López de Carrizosa²

¹Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector,Université Catholique de Louvain, ²Departamento de Fisiología, Facultad de Biología,Universidad de Sevilla

Summary

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass eine übermäßige Infiltration von Lipiden in der Skelettmuskulatur zu Lipotoxizität und Diabetes führt. Hier präsentieren wir ein vollständiges Protokoll, einschließlich Gewebeverarbeitung, Färbung mit Bodipy, Bildaufnahme und Analyse, um die Größe, Dichte und subzelluläre Verteilung von Lipidtröpfchen auf fasertypspezifische Weise zu quantifizieren.

Abstract

Die Lipidinfiltration der Skelettmuskulatur, bekannt als Myosteatose, nimmt mit Fettleibigkeit und Alterung zu. Myosteatose wurde kürzlich auch als negativer prognostischer Faktor für mehrere andere Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs entdeckt. Übermäßige Lipidinfiltration verringert die Muskelmasse und Kraft. Es führt auch zu Lipotoxizität und Insulinresistenz in Abhängigkeit vom gesamten intramyozellulären Lipidgehalt, der Lipidtröpfchenmorphologie (LD) und der subzellulären Verteilung. Der Fasertyp (oxidativ vs. glykolytisch) ist ebenfalls wichtig, da oxidative Fasern eine größere Kapazität zur Nutzung von Lipiden haben. Aufgrund ihrer entscheidenden Implikationen in der Pathophysiologie sind eingehende Studien zur LD-Dynamik und -Funktion in einer fasertypspezifischen Weise gerechtfertigt.

Hierin wird ein vollständiges Protokoll für die Quantifizierung des intramyozellulären Lipidgehalts und die Analyse der LD-Morphologie und der subzellulären Verteilung in einer fasertypspezifischen Weise vorgestellt. Dazu wurden serielle Muskelkryosektionen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Bodipy und Antikörpern gegen Myosin-Schwerkettenisoformen angefärbt. Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung verschiedener Muskeln, spart Zeit und vermeidet mögliche Artefakte und dank eines personalisierten Makros, das in Fidschi erstellt wurde, ist auch die Automatisierung der LD-Analyse möglich.

Introduction

Die Lipidinfiltration der Skelettmuskulatur, bekannt als Myosteatose, nimmt mit Fettleibigkeit und Alterung zu. Die Myosteatose korreliert negativ mit Muskelmasse und Kraft und mit der Insulinsensitivität¹. Darüber hinaus deuten neuere Studien darauf hin, dass der Grad der Myosteatose als prognostischer Faktor für andere Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen², nicht-alkoholische Fettlebererkrankungen³ oder Krebs⁴ verwendet werden könnte. Lipide können sich in der Skelettmuskulatur zwischen Muskelfasern als extramyozelluläre Lipide oder innerhalb der Fasern, als intramyozelluläre Lipide (IMCLs), ansammeln. IMCLs werden überwiegend als Triglyceride in Lipidtröpfchen (LDs) gespeichert, die als Stoffwechselbrennstoff bei körperlicher Betätigung verwendet werden ^5,6. Wenn jedoch das Lipidangebot die Nachfrage übersteigt oder wenn Mitochondrien dysfunktional werden, werden IMCLs an der Muskelinsulinresistenz beteiligt, wie sie bei metabolisch ungesunden, fettleibigen Personen und bei Typ-2-Diabetes-Patienten^{beobachtet wird 7}. Interessanterweise haben Ausdauersportler ähnliche, wenn nicht sogar höhere IMCLs-Spiegel wie bei adipösen Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus, während sie gleichzeitig eine hohe Insulinsensitivität beibehalten. Dieses Phänomen wird als “Athletenparadoxon”^8,9 beschrieben und wird durch eine nuanciertere Bewertung der Muskel-LDs in Bezug auf ihre Größe^, Dichte, Lokalisation, Dynamik und Zusammensetzung der Lipidspezies erklärt.

Erstens korreliert die LD-Größe umgekehrt mit der Insulinsensitivität und der körperlichen Fitness^10,11. Tatsächlich weisen kleinere LDs eine relativ größere Oberfläche für die Lipasewirkung auf und haben daher möglicherweise eine größere Fähigkeit, Lipide zu mobilisieren¹². Zweitens spielt die LD-Dichte (Anzahl/Oberfläche) eine umstrittene Rolle bei der Insulinwirkung ^8,10; Dennoch scheint es bei Athleten erhöht zu sein. Drittens ist die subzelluläre Lokalisation von LDs wichtig, da LDs, die sich direkt unter der Oberflächenmembran (subsarkolemmal oder peripher) befinden, eine schädlichere Wirkung auf die Insulinsensitivität ausüben als zentrale ^8,9,13. Letztere liefern Brennstoff für zentrale Mitochondrien, die eine größere Atmungsaktivität haben und spezialisierter sind, um den hohen Energiebedarf zu decken, der für die Kontraktion^{erforderlich ist 14}. Im Gegensatz dazu liefern periphere LDs subsarkolämale Mitochondrien, die an membranbezogenen Prozessen beteiligt sind⁸. Schließlich können über Triglyceride hinaus spezifische komplexe Lipide im Muskel schädlicher sein als andere. Zum Beispiel können sich Diacylglycerin, langkettiges Acyl-CoA und Ceramide im Muskel ansammeln, wenn die Triglycerid-Umsatzrate niedrig ist, wodurch die Insulinsignalisierung ^9,15 beeinträchtigt wird. Um auf das “Athletenparadoxon” zurückzukommen: Ausdauersportler haben eine hohe Anzahl kleinerer zentraler LDs mit erhöhten Fluktuationsraten in Typ I (oxidativen) Fasern, während adipöse und diabetische Patienten größere periphere LDs mit niedrigen Fluktuationsraten in Typ II (glykolytischen) Fasern haben ^8,15,16. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei der Energiespeicherung und -freisetzung könnten LDs über abgeleitete Fettsäuren (FA) und ein Mantelprotein (Perilipin 5) auch als kritische Akteure fungieren, die an der transkriptionellen Regulation der FA-Oxidation und der mitochondrialen Biogenese beteiligt sind⁸. Aufgrund ihrer entscheidenden Implikationen in der Physiologie und Pathophysiologie sind eingehende Studien über die Dynamik und Funktionen von LDs gerechtfertigt.

Obwohl es mehrere Techniken gibt, um IMCLs zu untersuchen, sind sie nicht alle geeignet, LD-Größe, -Dichte und -Verteilung auf faserspezifische Weise genau zu quantifizieren. Zum Beispiel bietet die Bewertung von IMCLs durch Magnetresonanzspektroskopie zwar nicht-invasiv, bietet aber eine Auflösung, die nicht ausreicht, um die Größe und genaue Position von LDs innerhalb der Faser zu untersuchen, und sie ist nicht fasertypspezifisch^17,18. Ebenso können biochemische Techniken, die an Ganzmuskelhomogenaten¹⁹ durchgeführt werden, die Lage und Größe von Lipiden nicht beurteilen. Folglich ist die am besten geeignete Methode zur Analyse der LD-Morphologie und -Ortung die quantitative elektronische Transmissionsmikroskopie^13, aber diese Technik ist teuer und zeitaufwendig. Daher hat sich die konfokale Fluoreszenzbildgebung auf Präparaten mit Farbstoffen wie Oil Red O (ORO)^20,21, Monodansylpentan (MDH)²² oder Bodipy^23,24,25 als das beste Werkzeug für diese Studien herausgestellt.

Hier wird ein vollständiges Protokoll beschrieben, einschließlich Gewebeentnahme und -verarbeitung, Bodipy-Färbung und konfokaler Bildaufnahme und -analyse zur Quantifizierung der LD-Größe, -Anzahl und -Lokalisation in Mausmuskel-Kryosektionen. Da IMCLs nicht gleichmäßig auf oxidative und glykolytische Fasern verteilt sind und jeder Fasertyp die LD-Dynamik unterschiedlich reguliert, muss die Untersuchung von IMCLs fasertypspezifisch^sein 16,25,26,27. Daher verwendet dieses Protokoll Immunfluoreszenz auf seriellen Abschnitten, um Myosin Heavy Chain (MyHC) Isoform(en) zu identifizieren, die von jeder Faser exprimiert werden. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die gleichzeitige Verarbeitung eines glykolytischen (Extensor digitorum longus, EDL) und eines oxidativen (Soleus) Muskels, die vor dem Einfrieren nebeneinander angeordnet sind (Abbildung 1). Diese gleichzeitige Verarbeitung spart nicht nur Zeit, sondern vermeidet auch Variabilität durch die getrennte Verarbeitung der Proben.

Abbildung 1: Schematische Übersicht des Vorgehens. Nach der Muskeldissektion (1) werden ausgewählte Muskeln ähnlicher Größe vorbereitet und zusammen eingefroren (2). Serielle Querschnitte von 10 μm werden mit einem Kryostaten erhalten und direkt auf Adhäsionsobjektträgern montiert (3). Aus zwei seriellen Objektträgern ist der erste (4A) für Laminin immunmarkiert und mit Bodipy gefärbt, um LDs zu erkennen, und der zweite (4B) ist mit Antikörpern gegen MyHCs zur Erkennung von Muskelfasertypen immunresistent. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop für Bodipy (5A) und einem Epifluoreszenzmikroskop für Muskelfasertypen (5B) aufgenommen. Die Bilder werden in Fidschi analysiert, indem ein Schwellenwert angewendet und Partikel (6A) quantifiziert werden, um die Anzahl, die durchschnittliche Größe, die Dichte und den Prozentsatz der Gesamtfläche zu erhalten, die von LDs (7) oder Zählzellen (6B) eingenommen wird, um den Prozentsatz der Fasern jedes Typs im Abschnitt (7) zu erhalten. Abkürzungen: LDs = Lipidtröpfchen; EDL = Extensor digitorum longus; MyHCs = Myosin-Schwerkettenisoformen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

Alle an Mäusen durchgeführten Verfahren wurden von der Ethikkommission für Tierversuche aus dem medizinischen Bereich der Université Catholique de Louvain genehmigt (2019/UCL/MD/013). 1. Sezierung und Vorbereitung der Proben zum Einfrieren Beschriften Sie ein 3 mm dickes Stück Kork für jedes Muskelpaar. Setzen Sie durch einen kleinen Einschnitt mit einer Klinge in der Mitte des Korkens senkrecht ein rechteckiges Stück starren Kunststoffs (0,5 cm W, 1…

Representative Results

Das hierin beschriebene Protokoll bietet eine effiziente Methode zur einfachen Quantifizierung von LDs in einer faserartigen und subzellularspezifischen Weise. Es zeigt, wie durch das Einfrieren von zwei Muskeln ähnlicher Größe, wie dem EDL und dem Soleus, die Zeit und die Ressourcen, die für die folgenden Schritte aufgewendet werden, um die Hälfte reduziert werden. Es wird ein vollständiges Protokoll für die Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse der verschiedenen MyHC-Isoformen berei…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Quantifizierung von LDs, die mit Bodipy auf einer faser- und subzellularspezifischen Basis markiert sind. In den letzten Jahren wurden klassische Lipidfarbstoffe wie ORO oder Sudan Black B durch eine neue Reihe von zelldurchlässigen, lipophilen, fluoreszierenden Farbstoffen ersetzt, die an neutrale Lipide binden (z. B. Bodipy). Bodipy ist als verschiedene Konjugate erhältlich und hat sich als sehr effektiv bei der Markierung von LDs erwiesen, um ihr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) und der Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care) unterstützt.C.M.S. erhält ein Ph.D.-Stipendium der FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. erhielt ein Stipendium des Wallonie-Bruxelles International Excellence Program.

Die Autoren danken Alice Monnier für ihren Beitrag zur Entwicklung dieses Protokolls und Caroline Bouzin für ihre Expertise und technische Hilfe bei der Bildaufnahme. Wir danken auch der Bildgebungsplattform 2IP-IREC für den Zugang zum Kryostaten und den Mikroskopen (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Brüssel, Belgien). Abschließend möchten sich die Autoren bei Nicolas Dubuisson, Romain Versele und Michel Abou-Samra für ihre konstruktive Kritik am Manuskript bedanken. Einige der Figuren dieses Artikels wurden mit BioRender.com erstellt.

Materials

Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix camera	Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera	Zeiss
Chemical hood	Potteau Labo	EN-14175
Confocal microscope	Zeiss	LSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick)	Electron Microscopy Sciences	63305
Cryo-Gloves	Tempshield	16072252
Cryostat	Thermo Scientific	Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745	Nikon
Dry Ice
Dumont Forceps	F.S.T	11295-10
Epifluorescence microscope	Zeiss	AxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T	14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm)	ThermoFisher	22-363-552	Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	BRAND Petri dish, MERK	BR455751	Used to place the muscles on ice during dissection
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen	Vector Labs	H-4000	Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections
Incubator	MMM Medcenter	Incucell 707
Microscope Cover Glasses (24×50 mm)	Assistent	40990151
Microscope Slide Boxes	Kartell	278	Used as humid chambers for immunohistochemistry
Neck holder	Linie zwo	SB-035X-02	Used as strap to hold the stainless steel tumbler
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade	Swann-Morton	0205
Paint brushes	Van Bleiswijck	Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Permanent Marker Pen Black	Klinipath/VWR	98307-R	Used to label slides
Pierce Fixation Forceps	F.S.T	18155-13
Polystyrene Box			H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3	Aesculap	BB073R
Stainless Steel Cup 10oz	Eboxer	B07GFCBPFH	Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing
Superfrost Ultra Plus slides	ThermoFisher	J1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teeth	Medische Vakhandel	1303152	Also called "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors – 3 mm Cutting Edge	F.S.T	15000-00
Weighing boats	VWR international	611-2249
Whole-Slide Scanner for Fluorescence	Zeiss	Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b	Sigma-Aldrich	SAB4600477	Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1	ThermoFisher	A-21121	Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM	Abcam	ab175702	Used at a final concentration of 1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody	ThermoFisher	A-21247	Used at a final concentration of 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)	ThermoFisher	D3922	Used at a final concentration of 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)	ThermoFisher	D3835	Used at a final concentration of 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFisher	D1306	Used at a final concentration of 0.5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8418	Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Sigma-Aldrich	1004969011	CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Isopentane GPR RectaPur	VWR international	24872.298	CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
Liquid Nitrogen			CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids.
Mouse on mouse Blocking Reagent	Vector Labs	MKB-2213-1	Used at concentration of 1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b	DSHB University of Iowa	BA-D5-supernatant	Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1	DSHB University of Iowa	SC-71-supernatant	Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM	Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa	6H1-supernatant	Used at a final concentration of 1:5
Normal Goat Serum (NGS)	Vector Labs	S-1000
PBS 0.1 M			Commonly used on histology laboratories
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P36930
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal)	Sigma-Aldrich	L0663	Used at a final concentration of 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Software
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.		Used to design the figures
Adobe Photoshop	Adobe Inc.		Confocal software
BioRender	https://biorender.com/		Used to design the figures
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/		Used to analyse the acquired images
Microsoft PowerPoint	Microsoft		Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types
Zen Blue 2.6	Zeiss		Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types

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Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-López de Carrizosa, M. A. Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63718, doi:10.3791/63718 (2022).