עדויות הולכות וגוברות מצביעות על כך שחדירה מוגזמת של שומנים בתוך שרירי השלד גורמת לליפטוקסיות ולסוכרת. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלם, כולל עיבוד רקמות, צביעה עם Bodipy, רכישת תמונה וניתוח, כדי לכמת את הגודל, הצפיפות וההתפלגות התת-תאית של טיפות שומנים באופן ספציפי מסוג סיבים.
חדירת שומנים בשריר השלד, המכונה מיואסטאטוזיס, עולה עם השמנת יתר והזדקנות. מיאוסטאטוזיס התגלתה לאחרונה גם כגורם פרוגנוסטי שלילי למספר הפרעות אחרות כגון מחלות לב וכלי דם וסרטן. חדירת שומנים מוגזמת מפחיתה את מסת השריר ואת כוחו. היא גם גורמת לליפטוקסיות ולתנגודת לאינסולין בהתאם לתכולת השומנים התוך-תאיים הכוללת, למורפולוגיה של טיפות השומנים (LD) ולפיזור התת-תאי. סוג הסיבים (חמצון לעומת גליקוליטי) חשוב גם הוא, שכן לסיבים חמצוניים יש יכולת גדולה יותר להשתמש בשומנים. בגלל ההשלכות הקריטיות שלהם בפתופיזיולוגיה, יש צורך במחקרים מעמיקים על דינמיקה ותפקוד של LD באופן ספציפי לסוג הסיבים.
להלן מוצג פרוטוקול מלא לכימות תכולת השומנים התוך-תאיים ולניתוח מורפולוגיה של LD והתפלגות תת-תאית באופן ספציפי לסוג הסיבים. לשם כך, קריוזקציות שרירים סדרתיות הוכתמו בצבע הפלואורסצנטי Bodipy ובנוגדנים נגד איזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין. פרוטוקול זה מאפשר עיבוד סימולטני של שרירים שונים, חוסך זמן ונמנע מממצאים אפשריים, ובזכות מאקרו מותאם אישית שנוצר בפיג’י, האוטומטיזציה של ניתוח LD אפשרית גם כן.
חדירת שומנים בשריר השלד, המכונה מיואסטאטוזיס, עולה עם השמנת יתר והזדקנות. מיואסטאטוזיס מתואמת באופן שלילי עם מסת שריר וכוח ועם רגישות לאינסולין1. יתר על כן, מחקרים אחרונים מצביעים על כך שמידת המיוסטאטוזיס יכולה לשמש כגורם פרוגנוסטי למצבים אחרים כגון מחלות לב וכלי דם2, מחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית3, או סרטן4. שומנים יכולים להצטבר בשרירי השלד בין סיבי השריר כשומנים חוץ-תאיים או בתוך הסיבים, כמו שומנים תוך-תאיים (IMCLs). IMCLs מאוחסנים בעיקר כטריגליצרידים בטיפות שומנים (LDs) המשמשים כדלק מטבולי במהלך פעילות גופנית 5,6. עם זאת, כאשר היצע השומנים עולה על הביקוש, או כאשר המיטוכונדריה הופכת לבלתי מתפקדת, IMCLs יהיו מעורבים בתנגודת לאינסולין בשרירים, כפי שניתן לראות אצל אנשים לא בריאים מבחינה מטבולית, שמנים ובחולי סוכרת מסוג 27. באופן מסקרן, לספורטאי סיבולת יש רמות דומות, אם לא גבוהות יותר, של IMCLs לאלה שנמצאו בחולים שמנים עם סוכרת מסוג 2, תוך שמירה על רגישות גבוהה לאינסולין. תופעה זו מתוארת כ”פרדוקס הספורטאי”8,9, והיא מוסברת על ידי הערכה ניואנסית יותר של LDs שרירים, הקשורים לגודלם, צפיפותם, לוקליזציה, דינמיקה והרכב מיני שומנים.
ראשית, גודל LD נמצא בקורלציה הפוכה לרגישות לאינסולין ולכושר גופני10,11. למעשה, LDs קטנים יותר מציגים שטח פנים גדול יחסית לפעולת ליפאז, ולכן, יש להם יכולת גדולה יותר לגייס שומנים12. שנית, צפיפות LD (מספר/משטח) ממלאת תפקיד שנוי במחלוקת בפעולתהאינסולין 8,10; עם זאת, נראה כי הוא גדל בספורטאים. שלישית, הלוקליזציה התת-תאית של LDs חשובה, שכן LDs הממוקמים ממש מתחת לממברנה של פני השטח (תת-סרקולמל או היקפי) מפעילים השפעה מזיקה יותר על הרגישות לאינסולין מאשר אלה המרכזיים 8,9,13. אלה האחרונים מספקים דלק למיטוכונדריה מרכזית, שיש לה פעילות נשימתית גדולה יותר ומתמחה יותר כדי לענות על הביקוש האנרגטי הגבוה הנדרש להתכווצות14. לעומת זאת, LDs היקפיים מספקים מיטוכונדריה תת-סרקולמלית, המעורבים בתהליכים הקשורים לממברנה8. לבסוף, מעבר לטריגליצרידים, שומנים מורכבים ספציפיים בתוך השריר עשויים להיות מזיקים יותר מאחרים. לדוגמה, דיאצילגליצרול, אציל-CoA ארוך שרשרת וסרמידים עשויים להצטבר בשריר כאשר שיעור תחלופת הטריגליצרידים נמוך, ובכך לפגוע באינסולין המאותתעל 9,15. אם נחזור ל”פרדוקס של הספורטאי”, לספורטאי סיבולת יש מספר גבוה של LDs מרכזיים קטנים יותר עם שיעורי תחלופה גבוהים בסיבים מסוג I (חמצוניים), בעוד שלחולי השמנת יתר וסוכרת יש LD היקפיים גדולים יותר עם שיעורי תחלופה נמוכים יותר בסיבים מסוג II (גליקוליטי) 8,15,16. בנוסף לתפקידם באגירת ושחרור אנרגיה, LDs באמצעות חומצות שומן נגזרות (FA) וחלבון פרווה (פריליפין 5) יכולים גם לתפקד כשחקנים קריטיים המעורבים בוויסות השעתוק של חמצון FA וביוגנזה מיטוכונדריאלית8. בגלל ההשלכות המכריעות שלהם בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה, יש הצדקה למחקרים מעמיקים על דינמיקה ותפקודים של LDs.
למרות שישנן מספר טכניקות לחקר IMCLs, לא כולן מתאימות לכימות מדויק של גודל LD, צפיפותו והתפלגותו באופן ספציפי לסיבים. לדוגמה, ההערכה של IMCLs על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית, למרות היותה לא פולשנית, מציעה רמת רזולוציה שאינה מספיקה כדי לחקור את הגודל והמיקום המדויק של LDs בתוך הסיבים, והיא אינה ספציפית מסוג סיבים17,18. כמו כן, טכניקות ביוכימיות המבוצעות על הומוגנטים של שרירים שלמים19 אינן יכולות להעריך את מיקומם וגודלם של שומנים. כתוצאה מכך, השיטה המתאימה ביותר לניתוח המורפולוגיה והמיקום של LD היא מיקרוסקופיה אלקטרונית של שידור כמותי13, אך טכניקה זו יקרה וגוזלת זמן רב. לכן, הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית על תכשירים עם צבעים כגון שמן אדום O (ORO)20,21, monodansylpentane (MDH)22, או Bodipy 23,24,25, התגלתה ככלי הטוב ביותר למחקרים אלה.
כאן מתואר פרוטוקול שלם, הכולל דגימה ועיבוד של רקמות, צביעת Bodipy, ורכישה וניתוח של תמונה קונפוקלית כדי לכמת את הגודל, המספר והלוקליזציה של LD בקריואזות שרירי העכבר. מאחר ש-IMCLs אינם מחולקים באופן שווה בין סיבים חמצוניים וגליקוליטיים, וכל סוג סיבים מווסת את הדינמיקה של LD באופן שונה, המחקר של IMCLs חייב להיות ספציפי מסוג סיבים 16,25,26,27. לכן, פרוטוקול זה משתמש באימונופלואורסצנציה בחתכים סדרתיים כדי לזהות איזופורמים של שרשרת כבדת מיוזין (MyHC) המבוטאים על ידי כל סיב. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא עיבוד סימולטני של שריר גליקוליטי (extensor digitorum longus, EDL) ושריר חמצוני (סולוס) המונחים זה לצד זה לפני הקפאה (איור 1). עיבוד סימולטני זה לא רק חוסך זמן אלא גם מונע השתנות עקב עיבוד נפרד של הדגימות.
איור 1: סקירה סכמטית של ההליך. לאחר כריתת שרירים (1), השרירים שנבחרו בגודל דומה מוכנים ומקפואים יחד (2). מקטעים רוחביים טוריים של 10 מיקרומטר מתקבלים באמצעות קריוסטאט ומורכבים ישירות על שקופיות הידבקות (3). משתי שקופיות סדרתיות, הראשונה (4A) מסומנת באופן חיסוני ללאמינין ומוכתמת ב-Bodipy כדי לזהות LDs והשנייה (4B) מוכתמת בנוגדנים נגד MyHCs לזיהוי סוגי סיבי שריר. התמונות נרכשות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עבור Bodipy (5A) ומיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי לסוגי סיבי שריר (5B). התמונות מנותחות בפיג’י על ידי החלת סף וכימות חלקיקים (6A) כדי לקבל את המספר, הגודל הממוצע, הצפיפות והאחוז של השטח הכולל שנכבש על ידי LDs (7) או ספירת תאים (6B) כדי לקבל את אחוז הסיבים מכל סוג בסעיף (7). קיצורים: LDs = טיפות שומנים; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = איזופורמים של שרשרת כבדה של מיוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
הפרוטוקול המפורט כאן מתאר שיטה יעילה לכימות LDs המתויגים עם Bodipy על בסיס ספציפי לסוג סיבים ותת-תאיים. בשנים האחרונות, צבעי שומנים קלאסיים, כגון ORO או סודן שחור B, הוחלפו במערך חדש של צבעים חדירים לתאים, ליפופיליים, פלואורסצנטיים הנקשרים לשומנים ניטרליים (למשל, Bodipy). Bodipy, הזמין כמצומדים שונים, הו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה-Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) ומ-Société Francophone du Diabète (טיפול בסוכרת SFD-Roche).C.M.S. הוא זוכה מלגת דוקטורט מטעם ה-FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. קיבל מלגה מתוכנית המצוינות הבינלאומית של וולוני-בריסל.
המחברים מודים לאליס מונייה על תרומתה לפיתוח פרוטוקול זה ולקרוליין בוזין על מומחיותה ועזרתה הטכנית בתהליך רכישת התמונה. אנו מודים גם לפלטפורמת ההדמיה 2IP-IREC על הגישה לקריוסטאט ולמיקרוסקופים (פלטפורמת הדמיה 2IP-IREC, המכון למחקר ניסויי וקליני, אוניברסיטת קתוליק דה לוביין, 1200 בריסל, בלגיה). לבסוף, המחברים מבקשים להודות לניקולס דובייסון, רומן ווסל ומישל אבו-סמרה על הביקורת הבונה על כתב היד. חלק מהדמויות של מאמרים אלה נוצרו עם BioRender.com.
Equipment | |||
AxioCam 506 mono 6 Mpix camera | Zeiss | ||
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera | Zeiss | ||
Chemical hood | Potteau Labo | EN-14175 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM800 | |
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
Cryo-Gloves | Tempshield | 16072252 | |
Cryostat | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
Dissecting Stereo Microscope SMZ745 | Nikon | ||
Dry Ice | |||
Dumont Forceps | F.S.T | 11295-10 | |
Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T | 14084-08 | |
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing |
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | BRAND Petri dish, MERK | BR455751 | Used to place the muscles on ice during dissection |
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen | Vector Labs | H-4000 | Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections |
Incubator | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
Microscope Cover Glasses (24×50 mm) | Assistent | 40990151 | |
Microscope Slide Boxes | Kartell | 278 | Used as humid chambers for immunohistochemistry |
Neck holder | Linie zwo | SB-035X-02 | Used as strap to hold the stainless steel tumbler |
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade | Swann-Morton | 0205 | |
Paint brushes | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections |
Permanent Marker Pen Black | Klinipath/VWR | 98307-R | Used to label slides |
Pierce Fixation Forceps | F.S.T | 18155-13 | |
Polystyrene Box | H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat | ||
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
Stainless Steel Cup 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing |
Superfrost Ultra Plus slides | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
Surgical tweezers 1/2 teeth | Medische Vakhandel | 1303152 | Also called "Rat teeth tweezers" |
Vannas Spring Scissors – 3 mm Cutting Edge | F.S.T | 15000-00 | |
Weighing boats | VWR international | 611-2249 | |
Whole-Slide Scanner for Fluorescence | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
Reagents | |||
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | Used at a final concentration of 1:500 |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | Used at a final concentration of 1:500 |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher | A-21247 | Used at a final concentration of 1:500 |
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) | ThermoFisher | D3835 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFisher | D1306 | Used at a final concentration of 0.5 µg/mL |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
Isopentane GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. |
Liquid Nitrogen | CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids. | ||
Mouse on mouse Blocking Reagent | Vector Labs | MKB-2213-1 | Used at concentration of 1:30 |
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b | DSHB University of Iowa | BA-D5-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 | DSHB University of Iowa | SC-71-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | 6H1-supernatant | Used at a final concentration of 1:5 |
Normal Goat Serum (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
PBS 0.1 M | Commonly used on histology laboratories | ||
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) | Sigma-Aldrich | L0663 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
Software | |||
Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
Adobe Photoshop | Adobe Inc. | Confocal software | |
BioRender | https://biorender.com/ | Used to design the figures | |
Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | Used to analyse the acquired images | |
Microsoft PowerPoint | Microsoft | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types | |
Zen Blue 2.6 | Zeiss | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types |