कंकाल की मांसपेशियों में लिपिड छोटी बूंद सामग्री का फाइबर प्रकार और उपकोशिकीय-विशिष्ट विश्लेषण
Summary
बढ़ते सबूत इंगित करते हैं कि कंकाल की मांसपेशियों के अंदर लिपिड की अत्यधिक घुसपैठ के परिणामस्वरूप लिपोटॉक्सिसिटी और मधुमेह होता है। यहां, हम फाइबर-प्रकार के विशिष्ट तरीके से लिपिड बूंदों के आकार, घनत्व और उपकोशिकीय वितरण को मापने के लिए ऊतक प्रसंस्करण, बोडिपी, छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के साथ धुंधला होने सहित एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
कंकाल की मांसपेशी लिपिड घुसपैठ, जिसे मायोस्टेटोसिस के रूप में जाना जाता है, मोटापे और उम्र बढ़ने के साथ बढ़ता है। मायोस्टेटोसिस को हाल ही में हृदय रोग और कैंसर जैसे कई अन्य विकारों के लिए एक नकारात्मक पूर्वानुमान कारक के रूप में भी खोजा गया है। अत्यधिक लिपिड घुसपैठ मांसपेशियों और ताकत को कम करता है। इसके परिणामस्वरूप कुल इंट्रामायोसेल्युलर लिपिड सामग्री, लिपिड ड्रॉपलेट (एलडी) आकृति विज्ञान और उपकोशिकीय वितरण के आधार पर लिपोटॉक्सिसिटी और इंसुलिन प्रतिरोध भी होता है। फाइबर प्रकार (ऑक्सीडेटिव बनाम ग्लाइकोलाइटिक) भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऑक्सीडेटिव फाइबर में लिपिड का उपयोग करने की अधिक क्षमता होती है। पैथोफिजियोलॉजी में उनके महत्वपूर्ण निहितार्थों के कारण, फाइबर प्रकार-विशिष्ट तरीके से एलडी गतिशीलता और कार्य पर गहन अध्ययन की आवश्यकता है।
इसमें, इंट्रामायोसेल्युलर लिपिड सामग्री की मात्रा का ठहराव और फाइबर प्रकार-विशिष्ट तरीके से एलडी आकृति विज्ञान और उपकोशिकीय वितरण के विश्लेषण के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह अंत करने के लिए, धारावाहिक मांसपेशी क्रायोसेक्शन फ्लोरोसेंट डाई बोडिपी और मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग थे। यह प्रोटोकॉल विभिन्न मांसपेशियों के एक साथ प्रसंस्करण को सक्षम बनाता है, समय की बचत करता है और संभावित कलाकृतियों से बचता है और फिजी में बनाए गए व्यक्तिगत मैक्रो के लिए धन्यवाद, एलडी विश्लेषण का स्वचालन भी संभव है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी लिपिड घुसपैठ, जिसे मायोस्टेटोसिस के रूप में जाना जाता है, मोटापे और उम्र बढ़ने के साथ बढ़ता है। मायोस्टेटोसिस मांसपेशियों और ताकत के साथ और इंसुलिन संवेदनशीलता के साथ नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध है1. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि मायोस्टेटोसिस की डिग्री का उपयोग अन्य स्थितियों जैसे हृदय रोग2, गैर-अल्कोहल फैटी यकृत रोग 3, या कैंसर4 के लिए पूर्वानुमान कारकके रूप में किया जा सकता है। लिपिड मांसपेशियों के तंतुओं के बीच कंकाल की मांसपेशियों में एक्स्ट्रामायोसेल्युलर लिपिड के रूप में या फाइबर के भीतर इंट्रामायोसेल्युलर लिपिड (आईएमसीएल) के रूप में जमा हो सकते हैं। आईएमसीएल मुख्य रूप से लिपिड बूंदों (एलडी) में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में संग्रहीत होते हैं जो शारीरिक व्यायाम 5,6 के दौरान चयापचय ईंधनके रूप में उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, जब लिपिड की आपूर्ति मांग से अधिक हो जाती है, या जब माइटोकॉन्ड्रिया बेकार हो जाता है, तो आईएमसीएल को मांसपेशियों के इंसुलिन प्रतिरोध में फंसाया जाएगा, जैसा कि चयापचय रूप से अस्वास्थ्यकर, मोटापे से ग्रस्त व्यक्तियों और टाइप 2 मधुमेह रोगियों में देखाजाता है। दिलचस्प बात यह है कि धीरज एथलीटों में उच्च इंसुलिन संवेदनशीलता बनाए रखते हुए टाइप 2 मधुमेह मेलिटस वाले मोटापे से ग्रस्त रोगियों में पाए जाने वाले आईएमसीएल के स्तर समान हैं, यदि उच्च नहीं हैं। इस घटना को “एथलीट के विरोधाभास” 8,9 के रूप में वर्णित किया गया है, और मांसपेशियों के एलडी के अधिक सूक्ष्म मूल्यांकन द्वारा समझाया गया है, जो उनके आकार, घनत्व, स्थानीयकरण, गतिशीलता और लिपिड प्रजातियों की संरचना से संबंधित है।
सबसे पहले, एलडी आकार इंसुलिन संवेदनशीलता और शारीरिक फिटनेस10,11 से विपरीत रूप से सहसंबद्ध है। वास्तव में, छोटे एलडी लाइपेज कार्रवाई के लिए अपेक्षाकृत अधिक सतह क्षेत्र प्रदर्शित करते हैं और इस प्रकार, संभावित रूप से लिपिड12 को जुटाने की अधिक क्षमता रखते हैं। दूसरा, एलडी घनत्व (संख्या / सतह) इंसुलिन कार्रवाई 8,10 में एक विवादास्पद भूमिका निभाता है; फिर भी, यह एथलीटों में वृद्धि हुई प्रतीत होती है। तीसरा, एलडी का उपकोशिकीय स्थानीयकरण महत्वपूर्ण है, क्योंकि सतह झिल्ली (सबसरकोलेम्मल या परिधीय) के ठीक नीचे स्थित एलडी केंद्रीय लोगों 8,9,13 की तुलना में इंसुलिन संवेदनशीलता पर अधिक हानिकारक प्रभाव डालते हैं। उत्तरार्द्ध केंद्रीय माइटोकॉन्ड्रिया को ईंधन प्रदान करता है, जिसमें अधिक श्वसन गतिविधि होती है और संकुचन14 के लिए आवश्यक उच्च ऊर्जा मांग को पूरा करने के लिए अधिक विशिष्ट होते हैं। इसके विपरीत, परिधीय एलडी सबसरकोलेमल माइटोकॉन्ड्रिया की आपूर्ति करते हैं, जो झिल्ली से संबंधित प्रक्रियाओं में शामिलहोते हैं 8. अंत में, ट्राइग्लिसराइड्स से परे, मांसपेशियों के भीतर विशिष्ट जटिल लिपिड दूसरों की तुलना में अधिक हानिकारक हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, डायसिलग्लिसरॉल, लंबी श्रृंखला एसाइल-सीओए और सेरामाइड्स मांसपेशियों में जमा हो सकते हैं जब ट्राइग्लिसराइड टर्नओवर दर कम होती है, जिससे इंसुलिन सिग्नलिंग 9,15 खराब हो जाती है। “एथलीट के विरोधाभास” पर लौटते हुए, धीरज एथलीटों में टाइप I (ऑक्सीडेटिव) फाइबर में ऊंची टर्नओवर दर के साथ छोटे केंद्रीय एलडी की एक उच्च संख्या होती है, जबकि मोटापे से ग्रस्त और मधुमेह रोगियों में टाइप II (ग्लाइकोलाइटिक) फाइबर 8,15,16 में कम टर्नओवर दरके साथ बड़े परिधीय एलडी होते हैं। ऊर्जा भंडारण और रिलीज में उनकी भूमिका के अलावा, व्युत्पन्न फैटी एसिड (एफए) और एक कोट प्रोटीन (पेरिलिपिन 5) के माध्यम से एलडी एफए ऑक्सीकरण और माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस8 के ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन में शामिल महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में भी कार्य कर सकते हैं। शरीर विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी में उनके महत्वपूर्ण निहितार्थों के कारण, एलडी गतिशीलता और कार्यों पर गहन अध्ययन की आवश्यकता है।
यद्यपि आईएमसीएल का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकें हैं, वे फाइबर-विशिष्ट तरीके से एलडी आकार, घनत्व और वितरण को सटीक रूप से मापने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। उदाहरण के लिए, चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा आईएमसीएल का मूल्यांकन, गैर-आक्रामक होने के दौरान, रिज़ॉल्यूशन का एक स्तर प्रदान करता है जो फाइबर के भीतर एलडी के आकार और सटीक स्थान का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त नहीं है, और यह फाइबर-प्रकार विशिष्ट17,18 नहीं है। इसी तरह, पूरे मांसपेशी होमोजेनेट्स19 पर की गई जैव रासायनिक तकनीक लिपिड के स्थान और आकार का आकलन नहीं कर सकती है। नतीजतन, एलडी आकृति विज्ञान और स्थान का विश्लेषण करने का सबसे पर्याप्त तरीका मात्रात्मक संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी13 है, लेकिन यह तकनीक महंगी और समय लेने वाली है। इसलिए, ऑयल रेड ओ (ओआरओ) 20,21, मोनोडैनसिलपेंटेन (एमडीएच) 22, या बोडिपी 23,24,25 जैसे रंगों के साथ तैयारी पर कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस इमेजिंग, इन अध्ययनों के लिए सबसे अच्छा उपकरण के रूप में उभरा है।
यहां, माउस मांसपेशी क्रायोसेक्शन में एलडी आकार, संख्या और स्थानीयकरण को मापने के लिए ऊतक नमूनाकरण और प्रसंस्करण, बोडिपी धुंधला, और कन्फोकल छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सहित एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। चूंकि आईएमसीएल ऑक्सीडेटिव और ग्लाइकोलाइटिक फाइबर के बीच समान रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं, और प्रत्येक फाइबर प्रकार एलडी गतिशीलता को अलग तरह से नियंत्रित करता है, आईएमसीएल का अध्ययन फाइबर-प्रकार विशिष्ट 16,25,26,27 होना चाहिए। इसलिए, यह प्रोटोकॉल प्रत्येक फाइबर द्वारा व्यक्त मायोसिन भारी श्रृंखला (एमवाईएचसी) आइसोफॉर्म (ओं) की पहचान करने के लिए धारावाहिक वर्गों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ एक ग्लाइकोलाइटिक (एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस, ईडीएल) और एक ऑक्सीडेटिव (एकमात्र) मांसपेशियों के एक साथ प्रसंस्करण ठंड (चित्रा 1) से पहले कंधे से कंधा मिलाकर रखा गया है। यह एक साथ प्रसंस्करण न केवल समय बचाता है बल्कि नमूनों के अलग-अलग प्रसंस्करण के कारण परिवर्तनशीलता से भी बचता है।
चित्रा 1: प्रक्रिया का योजनाबद्ध अवलोकन। मांसपेशियों के विच्छेदन (1) के बाद, समान आकार की चयनित मांसपेशियों को तैयार किया जाता है और एक साथ जमे हुए होते हैं (2). 10 μm के सीरियल अनुप्रस्थ वर्गों को क्रायोस्टैट का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है और सीधे आसंजन स्लाइड (3) पर घुड़सवार किया जाता है। दो धारावाहिक स्लाइडों से, पहला (4 ए) लैमिनिन के लिए इम्यूनोलेबल किया जाता है और एलडी को पहचानने के लिए बोडिपी के साथ दाग दिया जाता है और दूसरा (4 बी) मांसपेशियों के फाइबर प्रकारों की पहचान के लिए माईएचसी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेन किया जाता है। छवियों को बोडिपी (5 ए) के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और मांसपेशी फाइबर प्रकारों (5 बी) के लिए एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित किया जाता है। अनुभाग में प्रत्येक प्रकार के तंतुओं का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए एलडी (7) या गिनती कोशिकाओं (6 बी) द्वारा कब्जा किए गए कुल क्षेत्र की संख्या, औसत आकार, घनत्व और प्रतिशत प्राप्त करने के लिए एक थ्रेसहोल्ड और मात्रा निर्धारित कणों (6 ए) को लागू करके फिजी में छवियों का विश्लेषण किया जाता है। संक्षिप्त नाम: एलडी = लिपिड बूंदें; ईडीएल = एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस; मायएचसी = मायोसिन भारी श्रृंखला आइसोफॉर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां विस्तृत प्रोटोकॉल फाइबर-प्रकार- और उपकोशिकीय-विशिष्ट आधार पर बोडिपी के साथ टैग किए गए एलडी को मापने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। हाल के वर्षों में, शास्त्रीय लिपिड रंग, जैसे कि ओआरओ या सूडा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को फोंड्स नेशनल डे ला रेचेर्चे साइंटिफिक (एफएनआरएस-क्रेडिट डी रेचेर्चे जे.0022.20) और सोसाइटी फ्रैंकोफोन डु डायबेट (एसएफडी-रोश डायबिटीज केयर) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एमएडी-एलडीसी को वालोनी-ब्रुक्सेल्स इंटरनेशनल एक्सीलेंस प्रोग्राम से फैलोशिप मिली।
लेखकइस प्रोटोकॉल के विकास में उनके योगदान के लिए एलिस मोनियर और छवि अधिग्रहण प्रक्रिया में उनकी विशेषज्ञता और तकनीकी सहायता के लिए कैरोलीन बाउजिन को धन्यवाद देते हैं। हम क्रायोस्टैट और माइक्रोस्कोप (2 आईपी-आईआरईसी इमेजिंग प्लेटफॉर्म, प्रायोगिक और नैदानिक अनुसंधान संस्थान, यूनिवर्सिट कैथोलिक डी लौवेन, 1200 ब्रसेल्स, बेल्जियम) तक पहुंच के लिए 2 आईपी-आईआरईसी इमेजिंग प्लेटफॉर्म का भी धन्यवाद करते हैं। अंत में, लेखक पांडुलिपि की रचनात्मक आलोचना के लिए निकोलस डब्यूसन, रोमेन वर्सेल और मिशेल अबू-सामरा को धन्यवाद देना चाहते हैं। इन लेखों के कुछ आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| Equipment | |||
| AxioCam 506 mono 6 Mpix camera | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera | Zeiss | ||
| Chemical hood | Potteau Labo | EN-14175 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM800 | |
| Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Cryo-Gloves | Tempshield | 16072252 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
| Dissecting Stereo Microscope SMZ745 | Nikon | ||
| Dry Ice | |||
| Dumont Forceps | F.S.T | 11295-10 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T | 14084-08 | |
| FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing |
| Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | BRAND Petri dish, MERK | BR455751 | Used to place the muscles on ice during dissection |
| ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen | Vector Labs | H-4000 | Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections |
| Incubator | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| Microscope Cover Glasses (24×50 mm) | Assistent | 40990151 | |
| Microscope Slide Boxes | Kartell | 278 | Used as humid chambers for immunohistochemistry |
| Neck holder | Linie zwo | SB-035X-02 | Used as strap to hold the stainless steel tumbler |
| No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade | Swann-Morton | 0205 | |
| Paint brushes | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections |
| Permanent Marker Pen Black | Klinipath/VWR | 98307-R | Used to label slides |
| Pierce Fixation Forceps | F.S.T | 18155-13 | |
| Polystyrene Box | H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat | ||
| Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
| Stainless Steel Cup 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing |
| Superfrost Ultra Plus slides | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| Surgical tweezers 1/2 teeth | Medische Vakhandel | 1303152 | Also called "Rat teeth tweezers" |
| Vannas Spring Scissors – 3 mm Cutting Edge | F.S.T | 15000-00 | |
| Weighing boats | VWR international | 611-2249 | |
| Whole-Slide Scanner for Fluorescence | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher | A-21247 | Used at a final concentration of 1:500 |
| BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) | ThermoFisher | D3835 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFisher | D1306 | Used at a final concentration of 0.5 µg/mL |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Isopentane GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. |
| Liquid Nitrogen | CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids. | ||
| Mouse on mouse Blocking Reagent | Vector Labs | MKB-2213-1 | Used at concentration of 1:30 |
| Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b | DSHB University of Iowa | BA-D5-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 | DSHB University of Iowa | SC-71-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | 6H1-supernatant | Used at a final concentration of 1:5 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | Commonly used on histology laboratories | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) | Sigma-Aldrich | L0663 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | Confocal software | |
| BioRender | https://biorender.com/ | Used to design the figures | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | Used to analyse the acquired images | |
| Microsoft PowerPoint | Microsoft | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types |
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