증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.
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이 논문에서
요약
초록
근막증으로 알려진 골격근 지질 침투는 비만과 노화에 따라 증가합니다. 근막증은 또한 최근에 심혈관 질환 및 암과 같은 여러 다른 장애에 대한 부정적인 예후 인자로 발견되었습니다. 과도한 지질 침투는 근육 질량과 힘을 감소시킵니다. 또한 총 교내 세포 지질 함량, 지질 액적 (LD) 형태 및 아세포 분포에 따라 지방 독성 및 인슐린 저항성을 초래합니다. 섬유 유형 (산화 대 글리콜 성)도 중요한데, 산화 섬유는 지질을 활용할 수있는 능력이 더 크기 때문입니다. 병태생리학에 중요한 영향을 미치기 때문에 LD 역학과 섬유 유형별 기능에 대한 심층적 인 연구가 보장됩니다.
본원에서, 섬유유형별 방식으로 교내 지질 함량의 정량화 및 LD 형태학 및 아세포 분포의 분석을 위한 완전한 프로토콜이 제시된다. 이를 위해, 직렬 근육 동결절편을 형광 염료 보디피 및 미오신 중쇄 이소형에 대한 항체로 염색하였다. 이 프로토콜은 서로 다른 근육을 동시에 처리하여 시간을 절약하고 가능한 아티팩트를 피할 수 있으며 피지에서 생성 된 개인화 된 매크로 덕분에 LD 분석의 자동화도 가능합니다.
서론
근막증으로 알려진 골격근 지질 침투는 비만과 노화에 따라 증가합니다. 근막증은 근육량과 강도 및 인슐린 민감성과 부정적인 상관 관계가 있습니다1. 더욱이, 최근의 연구들은 근막증의 정도가 심혈관 질환2, 비알콜성 지방간 질환3 또는 암4과 같은 다른 병태에 대한 예후 인자로서 사용될 수 있음을 나타낸다. 지질은 근세포 외 지질로서 또는 섬유 내에서, 근세포 내 지질(IMCLs)로서 근섬유 사이의 골격근에 축적될 수 있다. IMCL은 주로 신체 운동 5,6 동안 대사 연료로 사용되는 지질 방울 (LDs)의 트리글리 세라이드로 저장됩니다. 그러나 지질 공급이 수요를 초과하거나 미토콘드리아가 기능 장애가되면 IMCL은 대사 적으로 건강에 좋지 않은 비만인 개인 및 제 2 형 당뇨병 환자7에서 볼 수 있듯이 근육 인슐린 저항성에 연루됩니다. 흥미롭게도, 지구력 운동 선수는 높은 인슐린 민감성을 유지하면서 제 2 형 당뇨병을 앓고있는 비만 환자에서 발견되는 것과 비슷한 수준의 IMCL을....
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프로토콜
마우스에 대해 수행 된 모든 절차는 Université Catholique de Louvain (2019 / UCL / MD / 013)의 의료 부문의 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동결을위한 샘플의 해부 및 준비
- 각 근육 쌍에 대해 3mm 두께의 코르크 조각에 라벨을 붙입니다.
- 코르크 중앙에 칼날로 만든 작은 절개를 통해 지지대 역할을 할 경질 플라스틱(0.5cm W, 1cm H)의 직사각형 조각을 수직으로 삽입합니다(그림 2B).
참고 : 직사각형 플라스틱 조각의 크기는 근육의 크기에 따라 다릅니다. 여기서, 설명된 치수는 3개월된 C57BL/6J 수컷 마우스의 단독(∼9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) 및 EDL(∼5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W)의 크기에 적응된다. - 해부시 마우스 뒷다리의 발바닥과 EDL을 제거하십시오. 해부 중에 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 식염수로 가볍게 적신 압축 위에 놓습니다.
참고 :이 두 사지 근육을 해부하는 방법에 대한 설명은 Wang et al.28 ....
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결과
본원에 기재된 프로토콜은 섬유 유형 및 아세포-특이적 방식으로 LDs를 용이하게 정량화하는 효율적인 방법을 제공한다. EDL과 발바닥과 같이 비슷한 크기의 두 근육을 함께 얼림으로써 다음 단계에 소요되는 시간과 자원이 어떻게 절반으로 감소하는지 보여줍니다.
성인 마우스 근육에서 발현된 상이한 MyHC 이소형의 면역염색, 이미지 획득 및 분석을 위한 완전한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 1989 년 Schiaffino et al. 3 3에 의해 처음 설계된 것을 기반으로하며, 라미닌을 표지하기 위해 추가 항체를 사용하는 것과 같은 일부 조정이 있습니다. 이러한 나중의 변형은 IIb 타입 섬유의 위치에 매우 중요하며, 이는 어떠한 항체로도 염색되지 않기 때문에 검정될 것이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 이러한 면역조직화학 프로토콜은 마우스의 느린 산화성(타입 I 및 IIa) 및 패스트-글리콜.......
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토론
여기에 자세히 설명된 프로토콜은 Bodipy로 태그가 지정된 LD를 섬유형 및 아세포별 기준으로 정량화하는 효율적인 방법을 설명합니다. 최근 몇 년 동안, ORO 또는 수단 블랙 B와 같은 고전적 지질 염료는 중성 지질 (예를 들어, Bodipy)에 결합하는 세포 투과성, 친유성, 형광 염료의 새로운 어레이로 치환되었다. 다른 컨쥬게이트로서 이용 가능한 Bodipy는 LDs를 태깅하여 다른 고정 조직 및 세포23,38,39,40뿐만 아니라 살아있는 세포 41,42에서도 다른 소기관과의 형태, 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 매우 효과적임이 입증되었습니다.
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공개 사항
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20)와 Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S.의 보조금으로 지원되었습니다. M.A.D.-L.d.C.는 Wallonie-Bruxelles International Excellence Program으로부터 펠로우십을 받았습니다.
저자는이 프로토콜 개발에 기여한 Alice Monnier와 이미지 수집 프로세스에 대한 전문 지식과 기술적 도움을 주신 Caroline Bouzin에게 감사드립니다. 우리는 또한 냉동 및 현미경 (2IP-IREC 이미징 플랫폼, 실험 및 임상 연구 연구소, Université Catholique de Louvain, 1200 브뤼셀, 벨기에)에 액세스 할 수있는 2IP-IREC 이미징 플랫폼에 감사드립니다. 마지막으로, 저자는 원고에 대한 건설적인 비판에 대해 Nicolas Dubuisson, Romain Versele 및 Michel Abou-Samra에게 감사하고 싶습니다. 이 기사의 인물 중 일부는 BioRender.com 로 작성되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| AxioCam 506 mono 6 Mpix 카메라 | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix CCD 카메라 | Zeiss | ||
| 화학 후드 | Potteau Labo | EN-14175 | |
| 컨포칼 현미경 | Zeiss | LSM800 | |
| 코르크 디스크 (ø 20mm, 두께 3mm) | 전자 현미경 과학 | 63305 | |
| 크라이오-글러브 | 템프쉴 | 16072252 | |
| 크라이오스탯 | 써모 사이언티픽 | Microm Cryo Star HM 560 | |
| 해부 스테레오 현미경 SMZ745 | Nikon | ||
| 드라이 아이스 | |||
| Dumont 집게 | F.S.T | 11295-10 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T | 14084-08 | |
| FisherBrand 일회용 베이스 몰드 (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | 코르크의 근육을 유지하기 위해 조각을 자르는 데 사용됩니다 |
| 유리 페트리 접시 (H 25 mm, &오슬래시; 150 mm) | BRAND Petri dish, MERK | BR455751 | 해부 중 근육을 얼음 위에 올려놓는 데 사용됩니다. |
| ImmEdge 소수성 장벽 PAP Pen | Vector Labs | H-4000 | 근육 부분 주변에 히드롭포비아 장벽을 만드는 데 사용됩니다 |
| 큐베이터 | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| 현미경 커버 안경 (24x50mm) | 보조 | ||
| 현미경 슬라이드 박스 | Kartell | 278 | 면역 조직 화학을위한 습한 챔버로 사용 |
| 넥 홀더 | Linie zwo | SB-035X-02 | 스테인레스 스틸 텀블러를 고정하기위한 스트랩으로 사용 |
| No 15 멸균 탄소강 메스 블레이드 | Swann-Morton | 0205 | |
| 페인트 브러시 | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | 냉동 절제 처리에 사용 |
| 영구 마커 펜 블랙 | Klinipath/VWR | 98307-R | 슬라이드에 Pierce |
| Fixation Forceps | F.S.T | 18155-13 | |
| 폴리스티렌 상자를 | H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, 액체 질소 용기로 사용되며 샘플을 cryostat | ||
| Scalpel Handle로 운반하는 데 사용됩니다. 메스 핸들, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
| 스테인레스 스틸 컵 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | 근육 동결을 위해 이소펜텐으로 채우는 텀블러 |
| Superfrost Ultra Plus 슬라이드 | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| 수술용 핀셋 1/2 치아 | Medische Vakhandel | 1303152 | "쥐 이빨 핀셋"이라고도 함 |
| Vannas 스프링 가위 - 3mm 커팅 엣지 | F.S.T | 15000-00 | |
| 계량 보트 | VWR 국제 | 611-2249 | |
| 전체 슬라이드 스캐너 | 형광 Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 405 염소 안티-마우스 IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | 최종 농도 1:500에서 사용 |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | 사용 1:500 |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) 2차 항체 | ThermoFisher | A-21247 | 1:500 |
| BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | 1 µ의 최종 농도에서 사용됩니다. g / mL |
| BODIPY-558 / 568 C12 (4,4- 디플루오로 -5- (2- 티에닐) -4- 보라 -3a, 4a - 디아자 -s- 인다센 -3- 도데 판산) | ThermoFisher | D3835 | 1 µ의 최종 농도에서 사용; g/mL |
| DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFisher | D1306 | 0.5 µ의 최종 농도에서 사용; g/mL |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | 1mg/mL 원액의 Bodipy를 해결하는 데 사용됩니다. CAUTION: 독성 및 인화성. 증기는 자극을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오. |
| 포름알데히드 용액 4%, 완충제, pH 6.9 | 시그마-알드리치 | 1004969011 | <강한>주의: 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 유전적 결함을 일으키는 것으로 의심됩니다. 암을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오. |
| Isopentane GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | 주의: 인화성이 매우 높은 액체 및 증기. 삼켜서 기도로 유입되면 치명적일 수 있습니다. 졸음이나 현기증을 유발할 수 있습니다. 반복적으로 노출되면 피부가 건조하거나 갈라질 수 있습니다. 보호 장갑/보호복/보안경/안면 보호구를 착용하십시오. |
| 액체 질소 | <강한>주의: 매우 춥습니다. 장갑을 착용하십시오. 끓거나 튀는 것을 최소화하기 위해 환기가 잘 되는 곳에서 천천히 다루십시오. 저온 액체용으로 설계된 용기를 사용하십시오. | ||
| 마우스 차단 시약 | Vector Labs | MKB-2213-1 | 1:30 |
| Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) 유전자 : MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b | DSHB University of Iowa | BA-D5-supertatanant | 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) 유전자의 최종 농도에서 사용 유전자 : MYH2, 단클론 소 안티 마우스 IgG1 | DSHB 아이오와 대학 | SC-71-상등액 | 1:10 |
| Myosin 중쇄 IIX 형 (6H1-s 기본 항체)의 최종 농도에서 사용, 유전자: MYH1, 단클론 토끼 안티 마우스 IgM | 발달 연구 하이브리도마 은행, 아이오와 대학교 | 6H1-상등액 | 1:5 |
| 정상 염소 세럼 (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | 조직학 실험실에서 일반적으로 사용됨 | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| 쥐 항-라미닌-2 (&알파;-2 사슬) 1차 항체 (단클론) | Sigma-Aldrich | L0663 | 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T 화합물 | Sakura | 4583 | |
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC | 어도비 Inc. | 피규어 Adobe | |
| Photoshop | Adobe Inc. | 컨 포칼 소프트웨어 | |
| BioRender | https://biorender.com/ | 그림을 디자인하는 데 사용 | |
| 피지 / ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | 획득 한 이미지를 분석하는 데 사용 | |
| 마이크로 소프트 파워 포인트 | 마이크로 소프트 | 유형을 스캔 한 후 전체 근육의 조직학을 재구성하는 데 사용 | |
| 젠 블루 2.6 | 자이스 | 섬유 유형을 스캔한 후 전체 근육의 조직학을 재구성하는 데 사용됩니다. |
참고문헌
- Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
- Miljkovic, I., et al.
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재인쇄 및 허가
