Identifikation af RNA-fragmenter som følge af enzymatisk nedbrydning ved anvendelse af MALDI-TOF massespektrometri
Summary
MALDI-TOF blev anvendt til at karakterisere fragmenter opnået ved reaktiviteten mellem oxideret RNA og exoribonuklease Xrn-1. Den foreliggende protokol beskriver en metode, der kan anvendes på andre processer, der involverer RNA og / eller DNA.
Abstract
RNA er en biopolymer, der er til stede i alle livets domæner, og dets interaktioner med andre molekyler og / eller reaktive arter, f.eks. DNA, proteiner, ioner, lægemidler og frie radikaler, er allestedsnærværende. Som et resultat gennemgår RNA forskellige reaktioner, der inkluderer dets spaltning, nedbrydning eller modifikation, hvilket fører til biologisk relevante arter med forskellige funktioner og implikationer. Et eksempel er oxidation af guanin til 7,8-dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), som kan forekomme i nærvær af reaktive oxygenarter (ROS). Samlet set er procedurer, der karakteriserer sådanne produkter og transformationer, stort set værdifulde for det videnskabelige samfund. Til dette formål er matrixassisteret laserdesorptionsioniseringstid (MALDI-TOF) massespektrometri en meget anvendt metode. Den foreliggende protokol beskriver, hvordan man karakteriserer RNA-fragmenter dannet efter enzymatisk behandling. Den valgte model anvender en reaktion mellem RNA og exoribonuklease Xrn-1, hvor enzymatisk fordøjelse standses på oxiderede steder. To lange RNA-sekvenser med 20 nukleotid [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] blev opnået ved fastfasesyntese, kvantificeret ved UV-vis-spektroskopi og karakteriseret via MALDI-TOF. De opnåede tråde blev derefter (1) 5′-fosforyleret og karakteriseret via MALDI-TOF; (2) behandlet med Xrn-1; 3) filtreret og afsaltet (4) analyseret via MALDI-TOF. Denne eksperimentelle opsætning førte til en entydig identifikation af fragmenterne i forbindelse med standsningen af Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] og [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beskrevne eksperimenter blev udført med 200 picomol RNA (20 pmol anvendt til MALDI-analyser); lavere mængder kan dog resultere i detekterbare toppe med spektrometre ved hjælp af laserkilder med mere effekt end den, der anvendes i dette arbejde. Det er vigtigt, at den beskrevne metode kan generaliseres og potentielt udvides til produktidentifikation for andre processer, der involverer RNA og DNA, og kan hjælpe med karakterisering / belysning af andre biokemiske veje.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 er en meget anvendt teknik til karakterisering og/eller påvisning af molekyler af varierende størrelse og egenskaber. Nogle af dets anvendelser omfatter forskellige anvendelser såsom påvisning af tanniner fra naturressourcer4, billeddannelse af metabolitter i fødevarer5, opdagelse eller overvågning af cellulære lægemiddelmål eller markører6 og klinisk diagnostik7, for at nævne nogle få. Af relevans for det nuværende arbejde er brugen af MALDI-TOF med DNA eller RNA, med dets anvendelse på oligonukleotider, der går tilbage til over tre årtier8, hvor flere begrænsninger blev noteret. Denne teknik har nu udviklet sig til et pålideligt, almindeligt anvendt middel til at karakterisere både biopolymerer9 og identificere/forstå kemiske og biokemiske reaktioner, f.eks. karakterisering af platinerede steder i RNA10, identifikation af RNA-fragmenter efter strengspaltning11,12 eller dannelse af protein-DNA-tværbindinger13 . Det er således værdifuldt at illustrere og fremhæve vigtige aspekter ved at bruge denne teknik. Det grundlæggende i MALDI-TOF er også beskrevet i videoformat14 og vil ikke blive uddybet yderligere heri. Desuden er dets anvendelse i en DNA- eller proteinsammenhæng tidligere blevet beskrevet og illustreret i det nævnte format 15,16,17.
Protokollen til påvisning af RNA-fragmenter dannet efter enzymatisk hydrolyse er rapporteret heri. Den eksperimentelle model blev valgt på baggrund af et nyligt fund offentliggjort af vores gruppe18, hvor MALDI-TOF blev brugt til at bestemme den unikke reaktivitet mellem exoribonuklease Xrn-1 og oligonukleotider af RNA indeholdende den oxidative læsion 8-oxoG. De lange 20-nukleotidstrenge blev opnået ved fastfasesyntese19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mens Xrn-1 blev udtrykt og renset efter den tidligere beskrevne rapport20. Kort fortalt er Xrn-121 en 5′-3′ exoribonuklease med forskellige biologiske nøgleroller, der nedbryder flere typer RNA, herunder oxideret RNA22. Det blev konstateret, at enzymets processivitet går i stå ved mødet med 8-oxoG, hvilket førte til RNA-fragmenter indeholdende 5′-phosphorylerede ender [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] og [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Endelig er det vigtigt at bemærke, at massespektrometri er en kraftfuld metode, der gennem forskellige metoder kan tilpasses til andre formål23,24; Derfor er det yderst vigtigt at vælge den rigtige ioniseringsmetode såvel som anden eksperimentel opsætning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den største udfordring i denne arbejdsgang opstod mellem færdiggørelsen af eksperimenterne og udførelsen af massespektrometriske analyser. Eksperimenter blev udført og afsluttet ved University of Colorado Denver og afsendt (natten over) til Colorado State University faciliteter. Dataindsamling blev udført ved modtagelse, som bekvemmelighed. Flere uventede omstændigheder førte til tidsforsinkelser i processen. I et tilfælde krævede uventede instrumentfejl, at prøverne blev frosset (en gang i 21 dage) inden spot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det er vigtigt at bemærke, at dette arbejde var et samarbejde mellem tre institutioner, to forskningsgrupper og en kernefacilitet. Fordelingen og arbejdsbyrden blev udført som følger: Protein (Xrn-1) ekspression blev udført ved University of Denver (Denver, CO). Oligonukleotidsyntese, kvantificering og eksperimentering (hovedsageligt enzymatisk nedbrydning) blev udført ved University of Colorado Denver (Denver, CO). Optimering blev også udført der. MALDI-TOF spotting, erhvervelse og analyse blev udført på Analytical Resources Core Facility ved Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS vil gerne anerkende en UROP Award (CU Denver) og Eureca tilskud (CU Denver) til støtte. E. G.C. anerkender støtte fra NIGMS via R00GM115757. MJER anerkender støtte fra NIGMS via 1R15GM132816. K.B. anerkender ressource-ID: SCR_021758. Arbejdet blev også støttet af en Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, fra Henry Dreyfus Foundation.
Materials
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2′-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. 생화학. 59 (15), 1493-1507 (2020).
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5′-mononucleotides by a 5′ leads to 3′ mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
