Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität
Summary
Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.
Abstract
Die Darmschleimhaut ist eine komplexe physikalische und biochemische Barriere, die eine Vielzahl wichtiger Funktionen erfüllt. Es ermöglicht den Transport, die Aufnahme und den Stoffwechsel von Nährstoffen und Xenobiotika und erleichtert gleichzeitig eine symbiotische Beziehung mit der Mikrobiota und begrenzt die Invasion von Mikroorganismen. Die funktionelle Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen und ihrer physikalischen und biochemischen Umgebung ist für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Homöostase des Darmgewebes von entscheidender Bedeutung. Die Modellierung dieser komplexen Wechselwirkungen und der integrierten Darmphysiologie in vitro ist ein gewaltiges Ziel mit dem Potenzial, die Art und Weise, wie neue therapeutische Ziele und Arzneimittelkandidaten entdeckt und entwickelt werden, zu verändern.
Organoide und Organ-on-a-Chip-Technologien wurden kürzlich kombiniert, um humanrelevante Darmchips zu erzeugen, die geeignet sind, die funktionellen Aspekte der Darmphysiologie und Pathophysiologie in vitro zu untersuchen. Organoide, die aus den Biopsien des Dünndarms (Zwölffingerdarm) und des Dickdarms gewonnen werden, werden in das obere Kompartiment eines Organchips gesät und dehnen sich dann erfolgreich als Monoschichten aus, während die unterschiedlichen zellulären, molekularen und funktionellen Merkmale jeder Darmregion erhalten bleiben. Gewebespezifische mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Darms werden in das untere Kompartiment des Organchips integriert, um die epithelial-endotheliale Schnittstelle nachzubilden. Diese neuartige Plattform erleichtert die luminale Exposition gegenüber Nährstoffen, Medikamenten und Mikroorganismen und ermöglicht Untersuchungen des Darmtransports, der Permeabilität und der Wirt-Mikroben-Interaktionen.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von Darmchips, die den menschlichen Zwölffingerdarm (Zwölffingerdarmchip) und Dickdarm (Dickdarmchip) darstellen, und deren anschließende Kultur unter kontinuierlicher Strömung und peristaltisartigen Verformungen bereitgestellt. Wir demonstrieren Methoden zur Beurteilung des Arzneimittelstoffwechsels und der CYP3A4-Induktion im Zwölffingerdarmchip anhand prototypischer Induktoren und Substrate. Schließlich bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die In-vitro-Modellierung von Interferon-gamma (IFNγ)-vermittelter Barrierestörung (Leaky-Gut-Syndrom) in einem Dickdarmchip an, einschließlich Methoden zur Bewertung der Veränderung der parazellulären Permeabilität, Veränderungen der Zytokinsekretion und transkriptomischer Profilierung der Zellen innerhalb des Chips.
Introduction
Der menschliche Darm ist ein komplexes und multitaskingfähiges Organ, das sich selbst regenerieren kann. Es ist in den Dünn- und Dickdarm unterteilt. Die Hauptfunktion des Dünndarms besteht darin, die aus dem Magen kommende Nahrung weiter zu verdauen, alle Nährstoffe aufzunehmen und die Rückstände an den Dickdarm weiterzugeben, der das Wasser und die Elektrolyte zurückgewinnt. Der Dünndarm ist weiter in mehrere anatomisch unterschiedliche Regionen unterteilt: Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum, von denen jede angepasst ist, um bestimmte Funktionen zu erfüllen. Zum Beispiel hilft der Zwölffingerdarm, den Speisebrei (Mageninhalt) abzubauen, um die richtige Aufnahme von Nährstoffen mit Proteinen, Kohlenhydraten, Vitaminen und Mineralien im Jejunum zu ermöglichen. Dieser proximale Teil des Dünndarms ist auch der Hauptort der intestinalen Arzneimittelabsorption und des Metabolismus und zeichnet sich durch die höhere Expression von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen (z. B. CYP3A4) im Vergleich zu ihrer Expression im Ileum und Dickdarm1 aus. Zusätzlich zu seiner Hauptrolle bei der Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen ist der Darm auch eine wirksame Barriere gegen potenziell schädliche luminale Inhaltsstoffe wie pathogene Mikroorganismen, mikrobielle Metaboliten, diätetische Antigene und Toxine 2,3. Es ist bemerkenswert, dass der menschliche Dickdarm von einer großen Anzahl von Mikroorganismen bewohnt wird, die weit über die der gesamten Zellen im menschlichen Körper hinausgehen, die viele Vorteile für Ernährung, Stoffwechsel und Immunität bieten. Daher ist die Aufrechterhaltung der Integrität der Schleimhautbarriere, die von Darmepithelzellen gebildet wird, entscheidend für die symbiotische Beziehung zwischen der Darmmikrobiota und den Wirtszellen, indem sie physisch getrennt werden, um eine unnötige Aktivierung von Immunzellen zu vermeiden2. Darüber hinaus spielt der programmierte Darmzelltod eine wesentliche Rolle als Selbstschutzmechanismus, der verhindert, dass infizierte Zellen persistieren oder sich vermehren – wodurch potenzielle Krankheitserregerverbreitet werden 3 -, während die kontinuierliche Selbsterneuerung des Darmepithels alle vier bis sieben Tage den Zellverlust kompensiert und die Barriereintegrität und Gewebehomöostase sicherstellt. Beeinträchtigungen der beschriebenen Darmfunktionen, einschließlich Nährstoffaufnahme, Barriereintegrität oder Ungleichgewicht beim Tod und der Selbsterneuerung von Darmzellen, können zur Entwicklung einer Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen führen, einschließlich Unterernährung und entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)2,3.
Zuvor wurden Tiermodelle und transformierte Krebs-abgeleitete Darmzelllinien verwendet, um die physiologischen und pathophysiologischen Funktionen des menschlichen Darmgewebes zu untersuchen. Immer deutlichere Bedenken hinsichtlich der Übertragbarkeit von Tierversuchen auf den Menschen, die durch das Vorhandensein erheblicher Unterschiede zwischen den beiden Arten verursacht werden, unterstrichen jedoch die Notwendigkeit humanrelevanter Alternativmethoden4. Zu den häufig verwendeten In-vitro-Darmzelllinien gehören T84-, Caco-2- und HT29-Zellen. Während sie bestimmte Aspekte der Darmbarrierefunktion und des Membrantransports nachahmen, sind sie durch eine veränderte Expression von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen5, Oberflächenrezeptoren und Transportern4 gekennzeichnet. Darüber hinaus fehlt es ihnen an Spezifität des Darmsegments und sie können die Komplexität des Darmepithels nicht rekapitulieren, wobei jedes Modell nur einen der fünf im Darm vorhandenen Epithelzelltypen enthält6.
Kürzlich wurden humane Darmorganoidkulturen, die aus frischen Biopsien des Dünndarms und des Dickdarms7,8 oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)9 hergestellt wurden, als alternative experimentelle Modelle mit dem Potenzial eingeführt, Tierversuche in Zukunft zu ergänzen, zu reduzieren und vielleicht zu ersetzen. Während iPS-Zellen auf nicht-invasive Weise erhalten werden können, erfordert die Etablierung von Organoiden aus iPS-Zellen die Verwendung komplexer und langwieriger Protokolle (mit mehreren experimentellen Schritten) und erzeugt Kulturen, die menschlichem fötalem Gewebe ähneln. Im Gegensatz dazu sind Biopsie-abgeleitete Organoide hochgradig skalierbar, da sie die inhärente Erneuerungskapazität von Darmgewebe nutzen können und auf unbestimmte Zeit in vitro durchgangen und vermehrt werden können. Wichtig ist, dass Biopsie-abgeleitete Organoide die krankheits- und darmregionenspezifischen Eigenschaften des primären Gewebes, aus dem sie entwickelt wurden, beibehalten und die zelluläre Vielfalt des Darmepithels nachahmen. Organoide können als patientenspezifische Avatare in vitro verwendet werden, um die Biologie und Pathogenese verschiedener Magen-Darm-Erkrankungen zu entschlüsseln und ihr therapeutisches Management zu verbessern. Obwohl Darmorganoide einen beeindruckenden Grad an physiologischer Funktionalität erreicht haben, können sie die Komplexität der nativen Organe aufgrund ihres Mangels an kritischen Stromakomponenten – einschließlich Blutgefäßen, Bindegewebe, peripheren Nerven und Immunzellen – sowie der mechanischen Stimulation immer noch nicht reproduzieren. Es ist bekannt, dass mechanische Parameter wie Strömung, Scherspannung, Dehnung und Druck die Morphogenese und Homöostase des Gewebes in vivo beeinflussen und in vitro 10,11,12,13 die Reifung von Zellen verbessern. Ein weiterer wichtiger Nachteil von Organoidsystemen ist die Unzugänglichkeit des Lumens und damit der apikalen Seite des Epithels. Dies stellt eine Herausforderung für die Untersuchung verschiedener Mechanismen dar, die mit der polarisierten Expression von Ionen- und Arzneimitteltransportern, Wirt-Mikrobiom-Interaktionen und pharmazeutischen Toxizitätstests verbunden sind. Schließlich leiden Organoidkulturen aufgrund der stochastischen Natur des In-vitro-Selbstorganisationsprozesses und der Wahl des Zellschicksals unter erhebliche Variabilität in Größe, Morphologie und Funktion. Um das volle Potenzial von Darmorganoiden in der Krankheitsmodellierung, im Arzneimittelscreening und in der regenerativen Medizin auszuschöpfen, ist es daher notwendig, neue Strategien zu erforschen, die die Variabilität in der Organoidentwicklung reduzieren, den Zugang zum luminalen Kompartiment verbessern und fehlende Zell-Zell-Interaktionen einbeziehen.
Die Organ-on-a-Chip-Technologie hat viele Techniken zur Integration mechanischer Kräfte und des Flüssigkeitsflusses in Darmzellkulturen in vitro eingeführt. Da jedoch die meisten der ersten Proof-of-Concept-Studien Krebszelllinien verwendet haben, die keine ausreichende zelluläre Vielfalt aufwiesen, wurde die Relevanz dieser Systeme in Frage gestellt. Vor kurzem haben wir intestinale Organoide und Organ-on-a-Chip-Technologie synergetisch kombiniert, um die besten Eigenschaften jedes Ansatzes in ein In-vitro-System zu integrieren 14,15,16. Der resultierende Darm-Chip rekapituliert die multizelluläre Architektur des Darmepithels, das Vorhandensein einer epithelial-endothelialen Gewebeschnittstelle und die mechanischen Kräfte des Flüssigkeitsflusses und der Dehnung, was die Emulation von Funktionen auf Organebene in vitro ermöglicht. Darüber hinaus erhöht die Verwendung von aus Primärgewebe gewonnenen Organoiden (die aus verschiedenen Regionen des menschlichen Darms entnommen werden können) als Ausgangsmaterial die Vielseitigkeit dieses Modells, da Chips, die den menschlichen Zwölffingerdarm, das Jejunum, das Ileum und den Dickdarm darstellen, nach ähnlichen Aussaat- und Kulturverfahren etabliert werden können. Wichtig ist, dass Darm-Chips eine Echtzeit-Bewertung von: der Integrität der Darmbarriere ermöglichen; Aktivität der Bürstengrenze und der Arzneimittelstoffwechselenzyme; Erzeugung von Mucinen; Sekretion von Zytokinen; und Interaktion von Darmzellen mit pathogenen und kommensalen Mikroorganismen, wie in den zuvor veröffentlichten Berichten gezeigt. Insbesondere als Darmchips mit Organoiden aus dem Gewebe verschiedener Individuen hergestellt wurden, erfassten diese Modelle die erwartete Variabilität zwischen den Spendern in den funktionellen Reaktionen auf verschiedene Medikamente und Behandlungen. Insgesamt öffnet die Verschmelzung von Organoiden mit der Organ-on-a-Chip-Technologie die Tür zu fortschrittlicheren, personalisierten, in vivo relevanten Modellen, die die physiologische Relevanz und Genauigkeit der In-vitro-Befunde sowie deren Extrapolation auf den Menschen verbessern könnten. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung des Darmchips und seiner Anwendung in den Studien der physiologischen Funktionen der beiden Darmsegmente Zwölffingerdarm und Dickdarm vorgestellt. Zunächst werden die Methoden zur Beurteilung der Aktivität des arzneimittelmetabolisierenden Enzyms CYP3A4 im Zwölffingerdarmchip sowie dessen Induktion durch prototypische Verbindungen wie Rifampicin und Vitamin D3 beschrieben. Zweitens sind die Schritte, die erforderlich sind, um den “undichten Darm” im Dickdarmchip zu modellieren, im Protokoll beschrieben, wobei die Störung der Epithelbarriere unter Verwendung von charakteristischen Zytokinen durchgeführt wird, die an der Pathogenese der IBD beteiligt sind. Kurz gesagt, Organoide, die aus menschlichen Biopsien gewonnen werden, werden in vitro vermehrt, einer enzymatischen Verdauung unterzogen und in den oberen Kanal des Chips eingeführt. Bei kontinuierlicher Perfusion mit wachstumsfaktorangereicherten Medien entwickeln sie sich zu einer konfluierenden epithelialen Monoschicht mit 3D-Architektur und einer leicht zugänglichen apikalen Zelloberfläche. Das untere, “vaskuläre” Chipkompartiment ist mit mikrovaskulären Endothelzellen bestückt, die aus dem Dünn- oder Dickdarm isoliert sind. Epithel und Endothel sind durch eine poröse dehnbare Membran getrennt, die die parakrinen Wechselwirkungen zwischen den beiden Geweben erleichtert und bei zyklischen Verformungen peristaltisähnliche Bewegungen des menschlichen Darms nachahmt. Die Kokultur wird unter den dynamischen Strömungsbedingungen gehalten, die durch luminale und vaskuläre Perfusion mit geeigneten Zellkulturmedien erzeugt werden. Schließlich beschreiben wir zahlreiche Arten von Assays und Endpunktanalysen, die direkt auf dem Chip oder aus entnommenen Zellkulturabwässern durchgeführt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kombination von Organ-on-a-Chip-Technologie und Darmorganoiden verspricht eine genaue Modellierung der menschlichen Darmphysiologie und Pathophysiologie. Hier stellen wir ein einfaches und robustes Schritt-für-Schritt-Protokoll (in Abbildung 1 dargestellt) für die Etablierung des Darmchips bereit, der biopsiebasierte Dünndarm- oder Kolonepithel- und intestinale mikrovaskuläre Endothelzellen enthält, die in einem mikrofluidischen Gerät kokultiviert werden. Diese chipbasierte Simulat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Professor Mark Donowitz für die Bereitstellung der aus der Darmbiopsie gewonnenen Organoide und Brett Clair für die Entwicklung der wissenschaftlichen Illustrationen des Chip-, tragbaren und Kulturmoduls. Der Rest der wissenschaftlichen Illustrationen wurde mit dem BioRender erstellt.
Materials
| small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| Biopsy-derived Human Duodenal Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Biopsy-derived Human Colonic Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Zoë CM-1™ Culture Module | Emulate Inc. | – | Culture module |
| Orb-HM1™ Hub Module | Emulate Inc. | – | 5% CO2, vacuum stretch, and power supply |
| Chip-S1™ Stretchable Chip | Emulate Inc. | – | Organ-Chip |
| Pod™ Portable Modules | Emulate Inc. | – | Portable module |
| UV Light Box | Emulate Inc. | – | – |
| Chip Cradle | Emulate Inc. | – | 1 per square culture dish |
| Steriflip®-HV Filters | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDF filter |
| Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | – |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | Sterile (autoclaved) | |
| Serological pipettes | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile | |
| Pipette | P20, P200, P1000 and standard multichannel | ||
| Pipette tips | P20, P200, and P1000. | ||
| Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL, 50 mL tubes |
| Eppendorf Tubes® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL tubes |
| 96 wells black walled plate | – | – | for epithelial permeability analysis |
| Microscope (with camera) | – | – | For bright-field imaging |
| Water bath (or beads) | – | – | Set to 37°C |
| Vacuum set-up | - | – | Minimum pressure: -70 kPa |
| Cell scrapers | Biotium | 220033 | |
| T75 flasks | BD Falcon | 353136 | Cell culture flask |
| Emulate Reagent-1 (ER-1) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
| Emulate Reagent-2 (ER-2) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
| Dulbecco’s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | For cell counting |
| TryplE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell technologies | 06010 | Organoid Growth Medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | Promocell | C-22121 | Endothelial medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
| Primocin™ | InvivoGen | ANT-PM-1 | antimicrobial agent |
| Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 | coating solution for flask |
| Matrigel – Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Solubilized basement membrane matrix |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | ECM component |
| Fibronectin | Corning | 356008 | ECM component |
| Y-27632 | Stem Cell technologies | 72304 | organoid media supplement |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | organoid media supplement |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Basement mebrane matrix dissociationsolution |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Sterile |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | Sterile, Water |
| DMSO | Sigma | D2650 | solvent |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg powder |
| Rifampicin (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP inducer |
| Testosterone hydrate | Sigma | T1500 | CYP substrate |
| 1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP inducer |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Sigma | 159002 | LCMS stop solution |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 157-4 | Fixative |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-Occludin | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | tight junctions marker |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | tight junctions marker |
| anti-E-cadherin | Abcam | ab1416 | epithelial adherens junctions marker |
| anti-VE-cadherin | Abcam | ab33168 | endothelial adherent junctions marker |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | tight junctions marker |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | nuclear stain |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | RNA lysis, isolation and purification kit |
| SuperScript™ IV VILO™ Master Mix | Invitrogen | 11756050 | reverse transcriptase kit |
| TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | qPCR reagent |
| QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28573 | Real-time PCR cycler |
| 18S primer | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S rRNA |
| CYP3A4 primer | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Cytochrome family 3 subfamily A member 4 |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23236 | Protein quantification kit |
| MSD Tris lysis buffer | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | Protein lysis buffer |
| Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit | Meso Scale Diagnostics | K15140D | Caspase 3 detection kit |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit | Meso Scale Diagnostics | K15198D | |
| V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | Meso Scale Diagnostics | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | – | Confocal microscope |
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss | – | 20X long-distance objective lenses |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss | – | Brightfield microscope |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss | – | 10X objective lenses |
References
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