ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化
Summary
生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。
Abstract
腸粘膜は、無数の重要な機能を果たす複雑な物理的および生化学的障壁である。それは微生物叢との共生関係を促進し、微生物の侵入を制限しながら、栄養素および生体異物の輸送、吸収および代謝を可能にする。様々な細胞型とその物理的および生化学的環境との間の機能的相互作用は、腸組織恒常性を確立し維持するために不可欠である。これらの複雑な相互作用と統合された腸内生理学を in vitroで モデル化することは、新しい治療標的および薬物候補の発見および開発方法を変革する可能性を秘めた手ごわい目標です。
オルガノイドとオルガン・オン・ア・チップ技術が最近組み合わされ、腸生理学および病態生理学の機能的側面を インビトロで研究するのに適したヒト関連腸チップが生成されました。小腸(十二指腸)および大腸の生検に由来するオルガノイドは、臓器チップの上部区画に播種され、各腸領域の明確な細胞、分子、および機能的特徴を維持しながら、単層として正常に拡張される。ヒト腸管組織特異的微小血管内皮細胞は、オルガンチップの底部区画に組み込まれ、上皮・内皮界面を再現する。この新規プラットフォームは、栄養素、薬物、および微生物への管腔曝露を容易にし、腸内輸送、透過性、および宿主 – 微生物相互作用の研究を可能にする。
ここでは、ヒト十二指腸(十二指腸チップ)および結腸(colon chip)を表す腸チップの樹立、ならびに連続的な流れおよび蠕動運動様変形下でのそれらのその後の培養のための詳細なプロトコルが提供される。我々は、プロトタイプ誘導物質および基質を用いて十二指腸チップにおける薬物代謝およびCYP3A4誘導を評価するための方法を示す。最後に、大腸チップ内のインターフェロンガンマ(IFNγ)媒介性バリア破壊(リーキーガット症候群)の in vitro モデリングのためのステップバイステップ手順を提供し、副細胞透過性の変化、サイトカイン分泌の変化、およびチップ内の細胞のトランスクリプトームプロファイリングを評価する方法を含む。
Introduction
人間の腸は、自己再生が可能な複雑でマルチタスクの器官です。それは小腸と大腸に分かれています。小腸の主な機能は、胃から来る食物をさらに消化し、すべての栄養素を吸収し、残渣を大腸に渡して水と電解質を回収することです。小腸はさらに、解剖学的に異なる複数の領域(十二指腸、空腸、回腸)に分割され、それぞれが特定の機能を実行するように適応されています。例えば、十二指腸は、空腸内のタンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラルを含む栄養素の適切な吸収を可能にするために、粥(胃の内容物)の分解を助けます。小腸のこの近位部は、腸管の薬物吸収および代謝の主要な部位でもあり、回腸および結腸1におけるそれらの発現と比較して、薬物代謝酵素(例えば、CYP3A4)の発現が高いことを特徴とする。栄養素の消化吸収におけるその主な役割に加えて、腸はまた、病原性微生物、微生物代謝産物、食事性抗原、および毒素などの潜在的に有害な管腔内容物に対する効果的な障壁でもある2,3。ヒトの結腸には、栄養、代謝、および免疫に多くの利点を提供する人体の全細胞のそれをはるかに超える多数の微生物が生息していることは注目に値する。したがって、腸上皮細胞によって形成される粘膜障壁の完全性の維持は、腸内微生物叢と宿主細胞との間の共生関係を物理的に分離して不必要な免疫細胞活性化を回避することを可能にするために重要である2。さらに、プログラムされた腸細胞死は、感染細胞が持続または増殖するのを防ぎ、それによって潜在的な病原体3を播種するのを防ぐ自己保護メカニズムとして重要な役割を果たし、4〜7日ごとに腸上皮の継続的な自己複製は、バリアの完全性および組織恒常性を保証する細胞喪失を補う。栄養吸収、バリア完全性、または腸細胞死および自己複製における不均衡を含む記載された腸機能の障害は、栄養失調および炎症性腸疾患(IBD)を含む様々な胃腸障害の発症をもたらし得る2,3。
これまで、動物モデルおよび形質転換癌由来腸細胞株は、ヒト腸組織の生理学的および病態生理学的機能を研究するために使用されてきた。しかし、2つの種の間に著しい格差が存在することによって引き起こされる、動物研究のヒトへの翻訳可能性に関するますます顕著な懸念は、ヒトに関連する代替方法の必要性を強調した4。一般的に使用される インビトロ 腸細胞株には、T84、Caco−2、およびHT29細胞が含まれる。それらは、腸管障壁機能および膜輸送の特定の態様を模倣するが、薬物代謝酵素5、表面受容体、およびトランスポーター4の発現の変化によって特徴付けられる。さらに、それらは腸セグメント特異性を欠いており、腸上皮の複雑さを再現することができず、各モデルは腸内に存在する5つの上皮細胞型のうちの1つしか含まない6。
最近、小腸および結腸7,8の新鮮な生検から確立されたヒト腸管オルガノイド培養物または人工多能性幹細胞(iPSC)9が、将来的に動物実験を補完し、減少させ、そしておそらく置き換える可能性のある代替実験モデルとして導入された。iPS細胞は非侵襲的な方法で入手することができますが、iPS細胞からオルガノイドを確立するには、複雑で長いプロトコル(いくつかの実験ステップを含む)を使用する必要があり、ヒト胎児組織に似た培養物を生成します。対照的に、生検由来オルガノイドは、腸組織の固有の再生能力を利用することができ、インビトロで無期限に継代および伝播することができるため、高度にスケーラブルである。重要なことに、生検由来オルガノイドは、それらが発達した一次組織の疾患および腸領域特異的特性を維持し、腸上皮の細胞多様性をエミュレートする。オルガノイドは、インビトロで患者固有のアバターとして使用して、さまざまな胃腸障害の生物学および病因を解明し、治療管理を改善することができます。腸オルガノイドは印象的な程度の生理学的機能を達成しているが、血管、結合組織、末梢神経、免疫細胞などの重要な間質成分の欠如や機械的刺激のために、天然の臓器の複雑さを再現できない。流れ、剪断応力、伸張、圧力などの機械的パラメータは、インビボでの組織形態形成および恒常性に影響を及ぼすことが知られており、インビトロでの細胞の成熟を改善することが以前に示されていた10、11、12、13。オルガノイド系のさらなる重要な欠点は、内腔、したがって上皮の頂端側にアクセスできないことである。これは、イオンおよび薬物トランスポーターの分極発現、宿主-マイクロバイオーム相互作用、および医薬品毒性試験に関連する様々なメカニズムを調査するための課題を提示する。最後に、オルガノイド培養物は、in vitro自己組織化プロセスおよび細胞運命の選択の確率的性質のために、サイズ、形態、および機能においてかなりのばらつきに苦しんでいる。したがって、疾患モデリング、薬物スクリーニング、再生医療における腸オルガノイドの可能性を最大限に引き出すためには、オルガノイド発生の変動性を低減し、管腔へのアクセスを改善し、欠損している細胞間相互作用を組み込む新しい戦略を探求する必要があります。
オルガンオンチップ技術は、インビトロで腸細胞培養物に機械的力および流体の流れを組み込むための多くの技術を導入している。しかし、初期の概念実証研究のほとんどは、十分な細胞多様性を示さなかった癌由来細胞株を使用していたため、これらの系の関連性は疑問視されてきた。最近、我々は腸オルガノイドと臓器オンチップ技術を相乗的に組み合わせ、各アプローチの最良の特徴を1つのin vitroシステムに組み込んだ14、15、16。得られた腸チップは、腸上皮の多細胞構造、上皮 – 内皮組織界面の存在、および流体の流れと伸張の機械的力を再現し、インビトロでの臓器レベルの機能のエミュレーションを可能にする。さらに、一次組織由来オルガノイド(ヒト腸のさまざまな領域からサンプリング可能)を出発材料として使用すると、ヒト十二指腸、空腸、回腸、結腸を表すチップを同様の播種および培養手順に従って確立できるため、このモデルの汎用性が向上します。重要なことに、腸チップは、腸バリアの完全性のリアルタイム評価を可能にします。ブラシ境界および薬物代謝酵素の活性;ムチンの生産;サイトカインの分泌;以前に発表された報告書で実証されているように、腸細胞と病原性および共生微生物との相互作用。特に、異なる個人の組織から生成されたオルガノイドを使用して腸チップが確立されたとき、これらのモデルは、様々な薬物および治療に対する機能的応答における予想されるドナー間変動性を捉えた。全体として、オルガノイドをOrgan-on-a-Chip技術とマージすることで、in vitro所見の生理学的関連性と精度、およびヒトへの外挿を改善できる、より高度でパーソナライズされたin vivo関連モデルへの扉が開かれます。ここでは、腸チップを確立し、2つの腸セグメントの生理学的機能の研究におけるその応用、すなわち十二指腸および結腸を確立するための詳細なプロトコルを提示する。まず、十二指腸チップ中の薬物代謝酵素CYP3A4の活性を評価するための方法、ならびにリファンピシンおよびビタミンD3などの原型化合物によるその誘導が記載されている。第二に、結腸チップの「リーキーガット」をモデル化するために必要なステップは、IBDの病因に関与する特徴的なサイトカインを使用して上皮障壁の破壊が行われているプロトコルに概説されている。簡単に述べると、ヒト生検に由来するオルガノイドは、インビトロで増殖させ、酵素消化を行い、チップの上部チャネルに導入する。成長因子富化培地との連続灌流の存在下で、それらは3Dアーキテクチャおよび容易にアクセス可能な頂端細胞表面を有するコンフルエントな上皮単分子層に発達する。底部には、「血管」チップコンパートメントが、小腸または大腸から単離された微小血管内皮細胞で播種される。上皮と内皮は多孔質の伸縮性膜によって分離されており、2つの組織間のパラクリン相互作用を促進し、周期的な変形を受けると、ヒト腸の蠕動運動様の動きをエミュレートする。共培養は、適切な細胞培養培地との管腔および血管灌流によって生じる動的流動条件下で維持される。最後に、オンチップまたはサンプリングされた細胞培養廃液から直接実行できる多数のタイプのアッセイおよびエンドポイント分析について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
臓器オンチップ技術と腸オルガノイドの組み合わせは、ヒトの腸内生理学および病態生理学の正確なモデリングに有望である。ここでは、マイクロ流体デバイスで共培養された生検由来小腸または結腸上皮と腸微小血管内皮細胞を含む腸チップの樹立のためのシンプルで堅牢なステップバイステッププロトコル( 図1に概説)を提供する。このチップベースのヒト腸のシミ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
腸生検由来オルガノイドを提供してくれたMark Donowitz教授と、チップ、ポータブル、培養モジュールの科学的なイラストレーションをデザインしてくれたBrett Clairに感謝します。残りの科学イラストはすべてBioRenderを使用して生成されました。
Materials
| small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| Biopsy-derived Human Duodenal Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Biopsy-derived Human Colonic Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Zoë CM-1™ Culture Module | Emulate Inc. | – | Culture module |
| Orb-HM1™ Hub Module | Emulate Inc. | – | 5% CO2, vacuum stretch, and power supply |
| Chip-S1™ Stretchable Chip | Emulate Inc. | – | Organ-Chip |
| Pod™ Portable Modules | Emulate Inc. | – | Portable module |
| UV Light Box | Emulate Inc. | – | – |
| Chip Cradle | Emulate Inc. | – | 1 per square culture dish |
| Steriflip®-HV Filters | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDF filter |
| Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | – |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | Sterile (autoclaved) | |
| Serological pipettes | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile | |
| Pipette | P20, P200, P1000 and standard multichannel | ||
| Pipette tips | P20, P200, and P1000. | ||
| Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL, 50 mL tubes |
| Eppendorf Tubes® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL tubes |
| 96 wells black walled plate | – | – | for epithelial permeability analysis |
| Microscope (with camera) | – | – | For bright-field imaging |
| Water bath (or beads) | – | – | Set to 37°C |
| Vacuum set-up | - | – | Minimum pressure: -70 kPa |
| Cell scrapers | Biotium | 220033 | |
| T75 flasks | BD Falcon | 353136 | Cell culture flask |
| Emulate Reagent-1 (ER-1) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
| Emulate Reagent-2 (ER-2) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
| Dulbecco’s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | For cell counting |
| TryplE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell technologies | 06010 | Organoid Growth Medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | Promocell | C-22121 | Endothelial medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
| Primocin™ | InvivoGen | ANT-PM-1 | antimicrobial agent |
| Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 | coating solution for flask |
| Matrigel – Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Solubilized basement membrane matrix |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | ECM component |
| Fibronectin | Corning | 356008 | ECM component |
| Y-27632 | Stem Cell technologies | 72304 | organoid media supplement |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | organoid media supplement |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Basement mebrane matrix dissociationsolution |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Sterile |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | Sterile, Water |
| DMSO | Sigma | D2650 | solvent |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg powder |
| Rifampicin (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP inducer |
| Testosterone hydrate | Sigma | T1500 | CYP substrate |
| 1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP inducer |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Sigma | 159002 | LCMS stop solution |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 157-4 | Fixative |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-Occludin | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | tight junctions marker |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | tight junctions marker |
| anti-E-cadherin | Abcam | ab1416 | epithelial adherens junctions marker |
| anti-VE-cadherin | Abcam | ab33168 | endothelial adherent junctions marker |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | tight junctions marker |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | nuclear stain |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | RNA lysis, isolation and purification kit |
| SuperScript™ IV VILO™ Master Mix | Invitrogen | 11756050 | reverse transcriptase kit |
| TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | qPCR reagent |
| QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28573 | Real-time PCR cycler |
| 18S primer | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S rRNA |
| CYP3A4 primer | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Cytochrome family 3 subfamily A member 4 |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23236 | Protein quantification kit |
| MSD Tris lysis buffer | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | Protein lysis buffer |
| Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit | Meso Scale Diagnostics | K15140D | Caspase 3 detection kit |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit | Meso Scale Diagnostics | K15198D | |
| V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | Meso Scale Diagnostics | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | – | Confocal microscope |
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss | – | 20X long-distance objective lenses |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss | – | Brightfield microscope |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss | – | 10X objective lenses |
References
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