Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal
Summary
Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.
Abstract
A mucosa intestinal é uma barreira física e bioquímica complexa que cumpre uma miríade de funções importantes. Permite o transporte, absorção e metabolismo de nutrientes e xenobióticos, facilitando uma relação simbiótica com a microbiota e restringindo a invasão de microrganismos. A interação funcional entre vários tipos celulares e seu ambiente físico e bioquímico é vital para estabelecer e manter a homeostase do tecido intestinal. Modelar essas interações complexas e a fisiologia intestinal integrada in vitro é um objetivo formidável com o potencial de transformar a forma como novos alvos terapêuticos e candidatos a medicamentos são descobertos e desenvolvidos.
Organoides e tecnologias organoides e organ-on-a-chip foram recentemente combinados para gerar chips intestinais relevantes para o homem adequados para estudar os aspectos funcionais da fisiologia intestinal e da fisiopatologia in vitro. Organoides derivados das biópsias do intestino delgado (duodeno) e intestino grosso são semeados no compartimento superior de um chip de órgão e, em seguida, expandem com sucesso como monocamadas, preservando as características celulares, moleculares e funcionais distintas de cada região intestinal. Células microvasculares microvasculares específicas do intestino humano são incorporadas no compartimento inferior do chip de órgão para recriar a interface epitelial-endotelial. Esta nova plataforma facilita a exposição luminal a nutrientes, drogas e microrganismos, permitindo estudos de transporte intestinal, permeabilidade e interações hospedeiro-micróbio.
Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para o estabelecimento de chips de intestino representando o duodeno humano (chip duodeno) e cólon (chip de cólon), e sua cultura subsequente sob fluxo contínuo e deformações semelhantes à peristalse. Demonstramos métodos para avaliar o metabolismo de drogas e indução CYP3A4 no chip duodeno usando indutores e substratos prototípicos. Por fim, fornecemos um procedimento passo-a-passo para a modelagem in vitro de interferon gama (IFNγ)-mediado ruptura de barreira (síndrome do intestino vazado) em um chip de cólon, incluindo métodos para avaliar a alteração da permeabilidade paracelular, alterações na secreção de citocinas e perfil transcriômico das células dentro do chip.
Introduction
O intestino humano é um órgão complexo e multitarefa capaz de auto-regeneração. É dividido em intestino delgado e grande. A função primária do intestino delgado é digerir ainda mais os alimentos provenientes do estômago, absorver todos os nutrientes e passar o resíduo para o intestino grosso, que recupera a água e os eletrólitos. O intestino delgado é ainda dividido em múltiplas regiões anatomicamente distintas: o duodeno, jejunum e íleo, cada um dos quais é adaptado para executar funções específicas. Por exemplo, o duodeno ajuda a quebrar o chyme (conteúdo estomacal) para permitir a absorção adequada de nutrientes envolvendo proteínas, carboidratos, vitaminas e minerais no jejunum. Esta parte proximal do intestino delgado também é o principal local de absorção e metabolismo de drogas intestinais, e é caracterizada pela maior expressão de enzimas metabolizadoras de drogas (por exemplo, CYP3A4) em comparação com sua expressão no íleo e cólon1. Além de seu papel principal na digestão e absorção de nutrientes, o intestino também é uma barreira eficaz contra conteúdos luminosos potencialmente prejudiciais, como microrganismos patogênicos, metabólitos microbianos, antígenos dietéticos e toxinas 2,3. Vale ressaltar que o cólon humano é habitado por um grande número de microrganismos, muito superior ao total de células do corpo humano, que proporcionam muitos benefícios à nutrição, metabolismo e imunidade. Portanto, a manutenção da integridade da barreira mucosa formada pelas células epiteliais intestinais é fundamental para permitir a relação simbiótica entre a microbiota intestinal e as células hospedeiras, separando-as fisicamente para evitar a ativação desnecessária das células imunes2. Além disso, a morte celular intestinal programada desempenha um papel essencial como um mecanismo de autoproteção que impede que as células infectadas persistam ou se proliferem — assim, disseminando potenciais patógenos3 — enquanto a auto-renovação contínua do epitélio intestinal a cada quatro ou sete dias compensa a perda celular que garante a integridade da barreira e a homeostase tecidual. Os prejuízos das funções intestinais descritas, incluindo absorção de nutrientes, integridade da barreira ou desequilíbrio na morte celular intestinal e autocon renovação, podem resultar no desenvolvimento de uma série de distúrbios gastrointestinais, incluindo desnutrição e doença inflamatória intestinal (DII)2,3.
Anteriormente, modelos animais e linhas de células intestinais derivadas do câncer foram utilizadas para estudar as funções fisiológicas e fisiodicosiológicas do tecido intestinal humano. No entanto, preocupações cada vez mais proeminentes sobre a tradução da pesquisa animal para os seres humanos, causada pela presença de disparidades significativas entre as duas espécies, destacaram a necessidade de métodos alternativos relevantes para o serhumano 4. As linhas de células intestinais in vitro comumente usadas incluem células T84, Caco-2 e HT29. Enquanto imitam certos aspectos da função da barreira intestinal e do transporte de membranas, eles são caracterizados por uma expressão alterada de enzimas metabolizantes de drogas5, receptores superficiais e transportadores4. Além disso, não possuem especificidade do segmento intestinal e não conseguem recapitular a complexidade do epitélio intestinal, com cada modelo contendo apenas um dos cinco tipos de células epiteliais presentes no intestino6.
Recentemente, culturas organoides intestinais humanas estabelecidas a partir de biópsias frescas do intestino delgado e do cólon 7,8 ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)9 foram introduzidas como modelos experimentais alternativos com potencial para complementar, reduzir e talvez substituir a experimentação animal no futuro. Embora os iPSCs possam ser obtidos de forma não invasiva, estabelecer organoides a partir de iPSCs requer o uso de protocolos complexos e demorados (com várias etapas experimentais) e gera culturas semelhantes ao tecido fetal humano. Em contraste, organoides derivados da biópsia são altamente escaláveis, pois podem aproveitar a capacidade de renovação inerente do tecido intestinal e podem ser indefinidamente passagemdos e propagados in vitro. É importante ressaltar que os organoides derivados da biópsia mantêm a doença e as características específicas da região intestinal do tecido primário do qual foram desenvolvidos e emulam a diversidade celular do epitélio intestinal. Organoides podem ser usados como avatares específicos do paciente in vitro para desvendar a biologia e a patogênese de vários distúrbios gastrointestinais e melhorar seu manejo terapêutico. Embora os organoides intestinais tenham alcançado um grau impressionante de funcionalidade fisiológica, eles ainda não conseguem reproduzir a complexidade dos órgãos nativos devido à falta de componentes estrômicos críticos — incluindo vasos sanguíneos, tecido conjuntivo, nervos periféricos e células imunes — bem como estimulação mecânica. Parâmetros mecânicos, como fluxo, estresse de cisalhamento, estiramento e pressão, são conhecidos por influenciar morfênese tecidual e homeostase in vivo e foram previamente mostrados para melhorar a maturação de células in vitro 10,11,12,13. Uma desvantagem importante adicional dos sistemas organoides é a inacessibilidade do lúmen e, portanto, para o lado apical do epitélio. Isso representa um desafio para investigar vários mecanismos associados à expressão polarizada de transportadores de íons e medicamentos, interações hospedeiro-microbioma e testes de toxicidade farmacêutica. Por fim, as culturas organoides sofrem de considerável variabilidade no tamanho, morfologia e função, devido à natureza estocástica do processo de auto-organização in vitro e escolhas de destino celular. Portanto, para perceber todo o potencial dos organoides intestinais na modelagem da doença, rastreamento de medicamentos e medicina regenerativa, é necessário explorar novas estratégias que reduzam a variabilidade no desenvolvimento organoide, melhorem o acesso ao compartimento luminal e incorporem interações células-células ausentes.
A tecnologia Organ-on-a-Chip introduziu muitas técnicas para a incorporação de forças mecânicas e fluxo de fluidos para culturas de células intestinais in vitro. No entanto, como a maioria dos estudos iniciais de prova de conceito tem usado linhas celulares derivadas do câncer que não apresentaram diversidade celular suficiente, a relevância desses sistemas tem sido questionada. Recentemente, combinamos sinergicamente organoides intestinais e tecnologia organ-on-a-chip para incorporar as melhores características de cada abordagem em um sistema in vitro 14,15,16. O intestino-chip resultante recapitula a arquitetura multicelular do epitélio intestinal, a presença da interface do tecido epitelial-endotelial, e as forças mecânicas de fluxo e estiramento de fluidos, permitindo a emulação das funções de nível de órgão in vitro. Além disso, o uso de organoides derivados do tecido primário (que podem ser amostrados de diferentes regiões do intestino humano) como material inicial aumenta a versatilidade deste modelo, pois chips representando duodeno humano, jejunum, ileum e cólon podem ser estabelecidos após procedimentos semelhantes de semeadura e cultura. É importante ressaltar que os intestino-chips permitem a avaliação em tempo real da integridade da barreira intestinal; atividade da borda da escova e enzimas de metabolismo de drogas; produção de mucinas; secreção de citocinas; e interação de células intestinais com microrganismos patogênicos e commensais, como demonstrado nos relatórios publicados anteriormente. Notavelmente, quando os chips do intestino foram estabelecidos utilizando organoides gerados a partir do tecido de diferentes indivíduos, esses modelos capturaram a variabilidade inter-doadora esperada nas respostas funcionais a vários medicamentos e tratamentos. Ao todo, a fusão de organoides com a tecnologia Organ-on-a-Chip abre as portas para modelos mais avançados, personalizados e relevantes que possam melhorar a relevância fisiológica e a precisão dos achados in vitro, bem como sua extrapolação para os seres humanos. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para o estabelecimento do chip intestinal e sua aplicação nos estudos das funções fisiológicas dos dois segmentos intestinais: duodeno e cólon. Em primeiro lugar, são descritos os métodos para avaliar a atividade da enzima metabolizadora cyp3A4 no chip duodeno, bem como sua indução por compostos prototípicos como rifampicina e vitamina D3. Em segundo lugar, as etapas necessárias para modelar o “intestino vazão” no chip de cólon são descritas no protocolo, com a interrupção da barreira epitelial sendo realizada usando citocinas marcantes implicadas na patogênese do IBD. Resumidamente, organoides derivados de biópsias humanas são propagados in vitro, submetidos à digestão enzimática, e introduzidos no canal superior do chip. Na presença de perfusão contínua com mídia enriquecida com fator de crescimento, eles se desenvolvem em uma monocamada epitelial confluente com arquitetura 3D e uma superfície celular apical facilmente acessível. O compartimento de chip “vascular” inferior é semeado com células endoteliais microvasculares isoladas do intestino delgado ou grande. O epitélio e o endotélio são separados por uma membrana porosa elástica, que facilita as interações paracrinas entre os dois tecidos e, quando submetidas a deformações cíclicas, emula movimentos semelhantes à peristalse do intestino humano. A cocultura é mantida sob as condições dinâmicas de fluxo geradas pela perfusão luminal e vascular com meios de cultura celular adequados. Finalmente, descrevemos inúmeros tipos de ensaios e análises de ponto final que podem ser realizadas diretamente no chip ou a partir de efluentes de cultura celular amostrada.
Protocol
Representative Results
Discussion
A combinação de tecnologia organ-on-a-chip e organoides intestinais promete modelagem precisa da fisiologia intestinal humana e da fisiopatologia. Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo simples e robusto (delineado na Figura 1) para o estabelecimento do chip intestinal contendo epitélio intestinal pequeno ou colonico derivado da biópsia e células endoteliais microvasculares intestinais co-cultivadas em um dispositivo microfluido. Esta simulação baseada em chip do intestino humano…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Professor Mark Donowitz por fornecer os organoides derivados da biópsia intestinal e Brett Clair por projetar as ilustrações científicas do chip, módulo portátil e cultural. Todas as outras ilustrações científicas foram geradas usando o BioRender.
Materials
| small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| Biopsy-derived Human Duodenal Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Biopsy-derived Human Colonic Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Zoë CM-1™ Culture Module | Emulate Inc. | – | Culture module |
| Orb-HM1™ Hub Module | Emulate Inc. | – | 5% CO2, vacuum stretch, and power supply |
| Chip-S1™ Stretchable Chip | Emulate Inc. | – | Organ-Chip |
| Pod™ Portable Modules | Emulate Inc. | – | Portable module |
| UV Light Box | Emulate Inc. | – | – |
| Chip Cradle | Emulate Inc. | – | 1 per square culture dish |
| Steriflip®-HV Filters | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDF filter |
| Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | – |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | Sterile (autoclaved) | |
| Serological pipettes | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile | |
| Pipette | P20, P200, P1000 and standard multichannel | ||
| Pipette tips | P20, P200, and P1000. | ||
| Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL, 50 mL tubes |
| Eppendorf Tubes® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL tubes |
| 96 wells black walled plate | – | – | for epithelial permeability analysis |
| Microscope (with camera) | – | – | For bright-field imaging |
| Water bath (or beads) | – | – | Set to 37°C |
| Vacuum set-up | - | – | Minimum pressure: -70 kPa |
| Cell scrapers | Biotium | 220033 | |
| T75 flasks | BD Falcon | 353136 | Cell culture flask |
| Emulate Reagent-1 (ER-1) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
| Emulate Reagent-2 (ER-2) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
| Dulbecco’s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | For cell counting |
| TryplE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell technologies | 06010 | Organoid Growth Medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | Promocell | C-22121 | Endothelial medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
| Primocin™ | InvivoGen | ANT-PM-1 | antimicrobial agent |
| Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 | coating solution for flask |
| Matrigel – Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Solubilized basement membrane matrix |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | ECM component |
| Fibronectin | Corning | 356008 | ECM component |
| Y-27632 | Stem Cell technologies | 72304 | organoid media supplement |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | organoid media supplement |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Basement mebrane matrix dissociationsolution |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Sterile |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | Sterile, Water |
| DMSO | Sigma | D2650 | solvent |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg powder |
| Rifampicin (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP inducer |
| Testosterone hydrate | Sigma | T1500 | CYP substrate |
| 1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP inducer |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Sigma | 159002 | LCMS stop solution |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 157-4 | Fixative |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-Occludin | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | tight junctions marker |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | tight junctions marker |
| anti-E-cadherin | Abcam | ab1416 | epithelial adherens junctions marker |
| anti-VE-cadherin | Abcam | ab33168 | endothelial adherent junctions marker |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | tight junctions marker |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | nuclear stain |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | RNA lysis, isolation and purification kit |
| SuperScript™ IV VILO™ Master Mix | Invitrogen | 11756050 | reverse transcriptase kit |
| TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | qPCR reagent |
| QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28573 | Real-time PCR cycler |
| 18S primer | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S rRNA |
| CYP3A4 primer | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Cytochrome family 3 subfamily A member 4 |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23236 | Protein quantification kit |
| MSD Tris lysis buffer | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | Protein lysis buffer |
| Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit | Meso Scale Diagnostics | K15140D | Caspase 3 detection kit |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit | Meso Scale Diagnostics | K15198D | |
| V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | Meso Scale Diagnostics | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | – | Confocal microscope |
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss | – | 20X long-distance objective lenses |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss | – | Brightfield microscope |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss | – | 10X objective lenses |
References
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