Vi presenterar ett protokoll för implementering av interferensreflektionsmikroskopi och total-intern-reflektion-fluorescensmikroskopi för samtidig avbildning av dynamiska mikrotubuli och fluorescerande märkta mikrotubuliassocierade proteiner.
Flera tekniker har använts för direkt visualisering av cytoskelettfilament och deras associerade proteiner. Total-intern-reflektion-fluorescens (TIRF) mikroskopi har ett högt signal-till-bakgrundsförhållande, men det lider av fotoblekning och fotoskada av de fluorescerande proteinerna. Etikettfria tekniker som interferensreflektionsmikroskopi (IRM) och interferometrisk spridningsmikroskopi (iSCAT) kringgår problemet med fotoblekning men kan inte lätt visualisera enskilda molekyler. Detta dokument presenterar ett protokoll för att kombinera IRM med ett kommersiellt TIRF-mikroskop för samtidig avbildning av mikrotubuliassocierade proteiner (MAPs) och dynamiska mikrotubuli in vitro. Detta protokoll möjliggör höghastighetsobservation av MAPs som interagerar med dynamiska mikrotubuli. Detta förbättrar befintliga tvåfärgade TIRF-inställningar genom att eliminera både behovet av mikrotubulimärkning och behovet av flera ytterligare optiska komponenter, såsom en andra excitationslaser. Båda kanalerna avbildas på samma kamerachip för att undvika problem med bildregistrering och ramsynkronisering. Denna inställning demonstreras genom att visualisera enstaka kinesinmolekyler som går på dynamiska mikrotubuli.
Total-intern-reflektion-fluorescens (TIRF) mikroskopi används ofta för visualisering av enstaka fluorescerande molekyler. Jämfört med epifluorescensavbildning uppnår TIRF överlägsen bakgrundsundertryckning, vilket möjliggör högupplöst lokalisering och spårning av enstaka fluoroforer. Av denna anledning är TIRF den föredragna metoden för att visualisera fluorescerande märkta mikrotubuliassocierade proteiner och används ofta för att avbilda mikrotubuli 1,2.
För att undersöka regleringen av mikrotubulidynamik av MAPs är det ofta nödvändigt att avbilda både mikrotubuli och MAPs samtidigt. De flesta befintliga metoder för detta ändamål är dyra eller lider av tekniska nackdelar. Samtidig tvåfärgad TIRF kräver till exempel två excitationslasrar och två kameror. Förutom den höga kostnaden utgör behovet av separata kameror ramsynkroniserings- och bildregistreringsproblem. Detta behov kan kringgås om en roterande filterkub används för att fysiskt växla mellan excitationslasrar i på varandra följande bildrutor3. I en sådan inställning kan ett enda kamerachip användas, och ramarna växlar mellan bilder av mikrotubuli och MAPs. Denna teknik begränsas dock av filterbytets hastighet, vilket vanligtvis begränsar bildhastigheten till mindre än 0,5 bildrutor per sekund3 (fps). En sådan bildhastighet är otillräcklig för att lösa snabba dynamiska processer, såsom krympning av en mikrotubuli som uppträder med en hastighet av upp till 500 nm / s, gång av ett kinesin med en hastighet i storleksordningen 800 nm / s, eller diffusion av en MAP som uppträder med diffusionskoefficienter som överstiger 0,3 μm2 / s4. Detta är särskilt problematiskt när man spårar de relativa positionerna för två rörliga mål i varje kanal, såsom positionen för en MAP i förhållande till positionen för en rörlig mikrotubulispets5.
Förutom dessa optiska begränsningar kräver tvåfärgad TIRF-mikroskopi att MAPs och mikrotubuli ska märkas med olika fluoroforer vars emissionsspektra är tillräckligt separerade. Fluorescerande märkning av tubulin kan förändra mikrotubulidynamik6, och fotoblekning av fluoroforer begränsar bildhastigheten7. På grund av dessa problem har etikettfria bildtekniker utvecklats för att visualisera mikrotubuli. Dessa inkluderar interferometrisk spridningsmikroskopi (iSCAT)8,9, roterande koherent-spridningsmikroskopi (ROCS)10, spatial ljusinterferensmikroskopi (SLIM)11 och interferensreflektionsmikroskopi (IRM)12,13. Dessa tekniker möjliggör snabb etikettfri avbildning av mikrotubuli utan nackdelarna med fluorescensavbildning, men de kan inte användas för att visualisera enskilda MAPs.
Av dessa etikettfria tekniker sticker IRM ut för sin låga kostnad och sina blygsamma krav på instrumentering. Vi har nyligen presenterat ett protokoll för att kombinera IRM med ett kommersiellt TIRF-mikroskop, vilket gör att mikrotubuli och fluorescerande MAPs kan avbildas i alternerande ramar 3,13. Detta dokument presenterar ett protokoll för att ändra denna inställning för att samtidigt fånga TIRF- och IRM-bilder på ett enda kamerachip. Detta innebär tillsats av en billig stråldelare i excitationsvägen för att samtidigt belysa provet med en TIRF-laser och en IRM LED-ljuskälla. En modifierad kommersiell bilddelare används för att spektralt separera TIRF- och IRM-signalerna och projicera dem på separata halvor av samma kamerachip. Vi använder också ett mikrofluidiskt system som möjliggör snabbt utbyte av reagens under avbildning. Detta protokoll beskriver hur denna inställning kan användas för att avbilda dynamiska mikrotubuli och MAPs. Apparatens förmåga demonstreras genom att presentera den första visualiseringen av kinesin-1-proteiner som går på krympande mikrotubuli, som fångas med en bildhastighet av 10 s-1.
Att studera regleringen av mikrotubulidynamiken med mikrotubuliassocierade proteiner (MAPs) kräver ofta samtidig avbildning av mikrotubuli och MAPs. Fluorescensmikroskopitekniker som TIRF används vanligtvis för detta ändamål. De är emellertid begränsade av nackdelarna med fluorescensavbildning, som inkluderar fotoblekning, fotoskada och behovet av fluoroformärkning. Etikettfria metoder, såsom IRM, är lämpliga för visualisering av mikrotubuli men kan inte avbilda enstaka fluoroforer. Detta protokoll kombinerar etikettfri IRM-avbildning och TIRF-mikroskopi för samtidig avbildning av dynamiska mikrotubuli och MAPs.
IRM-installationen använder en LED-belysningskälla filtrerad till >600 nm, medan TIRF-installationen använder en 488 nm laser. Vi använde en billig plattstråledelare för att reflektera belysningsljuset på provet och överföra den insamlade signalen till detektorn (figur 1). En stråldelare med 10% reflektans och 90% överföring valdes för att minimera förlusten av enmolekylsignalen. 90% förlust i belysningsljusintensiteten kompenseras genom att öka effekten av belysningslasern och lysdioden.
Spektral separation av signalerna uppnåddes med hjälp av en 90/10 (R / T) stråldelare och två spektralfilter (långpass 600 nm för IRM och bandpass 535/50 nm för TIRF). De spektralt separerade IRM- och TIRF-signalerna projiceras på två halvor av ett enda kamerachip med hjälp av en bilddelare. Användningen av en 90/10 stråldelare offrar 90% av IRM-signalen, men detta kompenseras genom att öka intensiteten hos LED-belysningskällan. En dikroisk spegel kan också användas här för att separera IRM- och TIRF-signalerna mer effektivt. Fluorescerande mikrober som ingår i analyserna möjliggör exakt inriktning av TIRF- och IRM-bilderna och fungerar som en referens för att fokusera målet.
Det mest kritiska optiska elementet i detta protokoll är målet med hög numerisk bländare (NA). Detta är viktigt inte bara för att uppnå total intern reflektion utan också för att maximera samlingens effektivitet och bildkontrast. Kvaliteten på de erhållna bilderna beror också på glasytans renhet och förvärvet av en tydlig bakgrundsbild för att korrigera för icke-enhetlig belysning och ta bort statiska funktioner. För IRM-avbildning rekommenderar vi att du använder långvåglängdsbelysning (>600 nm) för att minimera fotoskadorna hos mikrotubuli och proteiner. Detta är särskilt viktigt om en vit LED-ljuskälla används, i vilket fall ett långpassfilter bör inkluderas för att ta bort UV-ljus.
Detta protokoll möjliggör etikettfri, höghastighetsavbildning av dynamiska mikrotubuli och samtidig högupplöst visualisering av fluorescerande MAPs17. Jämfört med filterkubväxlingstekniken, som växlar mellan att ta bilder av mikrotubuli och MAPs, kan denna inställning mycket högre bildhastigheter eftersom den inte beror på den fysiska rotationen av en filterkub. Jämfört med tvåfärgade TIRF-avbildningstekniker använder denna teknik en mindre krävande optisk inställning och kringgår behovet av fluoroformärkning av mikrotubuli. De primära begränsningarna för denna inställning beror på TIRF-avbildning av MAPs; bildhastigheten begränsas av exponeringstiden för en fluorofor, och fotoblekning av fluoroforer är fortfarande en möjlighet. Icke desto mindre förbättrar detta protokoll befintliga tekniker eftersom det endast använder TIRF när det är nödvändigt (dvs. för att visualisera MAPs men inte mikrotubuli) och uppnår högsta möjliga hastighet inom gränserna för TIRF. Ytterligare förbättringar är endast möjliga om både mikrotubuli och MAPs visualiseras via en interferometrisk teknik, men detta kräver märkning av MAPs med metallnanopartiklar, vilket har sina begränsningar och experimentella utmaningar.
För att demonstrera kapaciteten hos denna teknik visualiserade vi samtidigt två snabba dynamiska processer via IRM och TIRF: krympningen av en mikrotubuli och gångningen av en fluorescerande kinesinmolekyl. Denna teknik har tidigare använts för att visualisera den snabba diffusionen av spastin på krympande mikrotubuli5. Utöver denna applikation på MAPs och mikrotubuli kan detta protokoll användas för att visualisera enstaka fluorescerande molekyler samtidigt med vilken makromolekylär struktur som helst som är tillräckligt massiv för att visualiseras via IRM, såsom ett cellmembran eller aktinfilament.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Thierry Emonets labb för att de delar renrumsutrustning. Vi tackar Yin-Wei Kuo för att ha förberett det renade eGFP-kinesinet som används i denna studie. Y.T. erkänner stödet från Alexander von Humboldt Foundation genom Feodor Lynen Research Fellowship. Detta arbete stöddes av NIH Grant R01 GM139337 (till J.H.).
10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |