גידול המוני ומחקרים מולקולריים בחרקים מזיקים בטורטריים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שיטת הגידול של חרקים מזיקים טורטריים במעבדות. ההליכים להבחנה בין מין החרקים ולמיצוי חומצות גרעין לריצוף בתפוקה גבוהה נקבעים באמצעות שני מזיקים מומנטיים.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), הידוע בכינויו טורטריקס או עש עלים, כולל מזיקים חקלאיים וייעוריים רבים, הגורמים להפסדים חקלאיים חמורים. כדי להבין את הביולוגיה של עשים מזיקים כאלה, טכניקות בסיסיות היו מבוקשות מאוד. כאן, שיטות לגידול מסה, תצפיות ומחקרים מולקולריים מפותחות באמצעות שני טורטריקס תה, Homona magnanima ו – Adoxophyes honmai (לפידופטרה: Tortricidae). חרקים גודלו באופן המוני עם תזונה מלאכותית פרוסה ונשמרו על ידי רבייה במשך יותר מ-100 דורות על ידי התחשבות בתכונות הביולוגיות שלהם. לחרקים יש דימורפיזמים מיניים שונים; לפיכך קשה להבחין בין המין בשלבי ההתפתחות, שמנעו בדיקות עוקבות. העבודה הנוכחית הדגישה כי ניתן לקבוע את המין של זחלי הטורטרידים על ידי התבוננות באשכים או בכתמי אורצין לקטיים-אצטיים כדי לדמיין את כרומוזום W הספציפי לנקבה. יתר על כן, באמצעות שיטות קביעת המין, המחקר הנוכחי איפשר מיצוי חומצות גרעין ממין קבע עוברים ויישום לקראת ריצוף בתפוקה גבוהה. טיפים אלה ישימים עבור חרקים מזיקים אחרים ויאפשרו מחקרים מורפולוגיים וגנטיים נוספים.
Introduction
חרקי לפידופטרן מייצגים יותר מ-10% מכלל המינים החיים המתוארים1, ומיני טקסה מסוימים גורמים נזק חמור לצמחים ולאובדן חקלאי חמור 2,3. למרות שמחקרים מולקולריים וגנטיים פותחו באמצעות חרקי מודל כגון תולעת המשי בומביקס מורי 4,5, חרקים מזיקים נותרים ללא התערבות, בין היתר בגלל קשיי הגידול והטיפולב-6,7. לכן, מחקרים בסיסיים וטכניקות נחוצים כדי להבין את הביולוגיה של חרקים מזיקים כאלה שאינם מודל.
ה-Tortricidae (Lepidoptera), הידוע בכינויו טורטריקס או עש עלים, כולל מזיקים חקלאיים וייעוריים רבים8. מבין טקסי החרקים, טורטריקס התה האוריינטלי Homona magnanima Diakonoff ופירות הקיץ Tortrix Adoxophyes honmai Yasuda הם מזיקים פוליפגוטיים רציניים הידועים כמזיקים לעצי תה במזרח אסיה7. שני המינים מטילים אשכולות ביצים שטוחים וסגלגלים דמויי קשקשים (או מסות ביצים) המורכבים מביצים דקות, רכות ושבריריות המכוסות בהפרשות אימהיות. אף על פי ששלבי העוברים הם חיוניים להתפתחות החרקים ולקביעת המין9, מבנים של הביציות מונעים ניתוח נוסף מהבנת הביולוגיה של החרקים. חשוב להתגבר על הקשיים למחקר נוסף על מזיקים המזיקים המסתבכים עם מסת ביצה מורכבת כזו.
כאן, כדי להבין את הביולוגיה של טורטרידים, פותחו שיטות לגידול מסה, תצפיות ומחקרים מולקולריים באמצעות A. honmai ו – H. magnanima. ראשית, שיטות גידול המוני שומרות על שני הטורטרידים במשך 100 דורות על ידי גזע. הפרדת הביציות ממסת הביצית דמוית הקשקשים המשורשרים אפשרה תצפית עוברית על הטורטרידים באמצעות ממיסים אלקליין ואורגניים שפותחו בעבר מטכניקות ששימשו בזבובים10. בנוסף, המחקר הנוכחי ביסס אפליה מינית של עוברים קטנים על ידי פיתוח שיטות צביעה של כרומטין המין של נקבות lepidopteran באמצעות orcein לקטי-אצטי11. על ידי שילוב שיטות אלה, חומצות גרעין באיכות גבוהה ובכמות הופקו מעוברים שנקבעו על ידי מין, שאחרת היה קשה לקבוע6. הרנ”א שחולץ שימש לריצוף הדור הבא. באופן קולקטיבי, השיטות המוצגות כאן חלות על חרקים לפידופטרנים אחרים ועל טקסות חרקים אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
טורטרייד כולל מספר מזיקים חקלאיים וייעוריים; המחקר הנוכחי הציג שיטות לגידול טורטריקס במשך דורות, התבוננות באמבריוגנזה ובמין של החרקים, וביצוע אנליזה מולקולרית באמצעות עוברים בוגרים.
אחד המכשולים בחקר חרקי ההדברה הוא קביעת שיטות גידול. במיוחד, הרבייה לפעמים להשפיע על הכוש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות על תמיכת האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) במלגות מחקר למדענים צעירים [מענק מספר 19J13123 ו- 21J00895].
Materials
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
References
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).
- Matsuura, H., Naito, A. Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).
- Mita, K., et al. The construction of an EST database for Bombyx mori and its application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).
- Kawamoto, M., et al. High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).
- Fukui, T., et al. In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).
- Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis. Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).
- vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. . Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , (1991).
- Kiuchi, T., et al. A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Kageyama, D., Traut, W. Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis. Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).
- Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima. Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).
- Schalamun, M., et al. Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora. Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).
- Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments. Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).
- Saccheri, I., et al. Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation. Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).
- Crnokrak, P., Roff, D. A. Inbreeding depression in the wild. Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).
- Keller, L. F., Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).
- Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host. Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).
