Den nåværende protokollen beskriver oppdrettsmetoden for tortricid skadedyrsinsekter i laboratoriene. Prosedyrene for å skille insekters kjønn og trekke ut nukleinsyrer for høy gjennomstrømningssekvensering etableres ved hjelp av to tortricid.
Tortricidae (Lepidoptera), kjent som tortrix eller leafroller møll, består av mange landbruks- og skogbruk, noe som forårsaker alvorlige landbrukstap. For å forstå biologien til slike skadedyrmøller har grunnleggende teknikker vært etterspurt. Her utvikles metoder for masseoppdrett, observasjoner og molekylære studier ved hjelp av to te tortrix, Homona magnanima og Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Insekter ble masseoppdratt med skiver kunstig kosthold og opprettholdt ved innavl i over 100 generasjoner ved å vurdere deres biologiske egenskaper. Insekter har ulike sex dimorfismer; Derfor er det vanskelig å skille kjønn i utviklingsstadiene, noe som har forhindret etterfølgende analyser. Det nåværende arbeidet fremhevet at tortricids larver kan bestemmes ved å observere testikler eller melke-eddik-orceinfarging for å visualisere det kvinnespesifikke W-kromosomet. Videre, ved hjelp av kjønnsbestemmelsesmetodene, aktiverte den nåværende studien nukleinsyreekstraksjoner fra kjønnsbestemte embryoer og anvendelse mot høy gjennomstrømningssekvensering. Disse tipsene gjelder for andre skadedyrsinsekter og vil lette ytterligere morfologiske og genetiske studier.
Lepidopteran insekter representerer mer enn 10% av alle beskrevne levende arter1, og visse taxa arter forårsaker alvorlig skade på planter og alvorlige landbrukstap 2,3. Selv om molekylære og genetiske studier er utviklet ved hjelp av modellinsekter som silkeorm bombyx mori 4,5, forblir skadedyrsinsekter uinvestert, delvis på grunn av vanskelighetene med oppdrett og håndteringav 6,7. Derfor er grunnleggende studier og teknikker nødvendige for å forstå biologien til slike ikke-modell skadedyrsinsekter.
Tortricidae (Lepidoptera), kjent som tortrix eller leafroller møll, består av mange landbruks- og skogbruk skadedyr8. Av insekt taxa er orientalsk te tortrix Homona magnanima Diakonoff og sommerfrukt tortrix Adoxophyes honmai Yasuda alvorlige polyfagiske kjent for å skade tetrær i Øst-Asia7. De to artene lå flate og ovale skalalignende eggklynger (eller eggmasser) bestående av tynne, myke og skjøre egg dekket av mors sekreter. Selv om embryogenesestadier er avgjørende for insektutvikling og kjønnsbestemmelse9, forhindrer eggstrukturer videre analyse fra å forstå insektens biologi. Det er viktig å overvinne vanskelighetene for videre studier på som ovipositing slike komplekse eggmasse.
Her, for å forstå biologien til tortricids, er metoder for masseoppdrett, observasjoner og molekylære studier utviklet ved hjelp av A. honmai og H. magnanima. For det første opprettholder masseoppdrettsmetoder begge tortricids over 100 generasjoner av innavl. Separasjonen av egg fra den sammenkoblede skalalignende eggmassen forenklet embryogeneseobservasjon av tortricidene ved hjelp av alkaliske og organiske løsningsmidler som tidligere ble utviklet fra teknikker som brukes i fluer10. I tillegg etablerte den nåværende studien kjønnsdiskriminering av små embryoer ved å utvikle fargingsmetoder for kjønnskromatin hos lepidopteran kvinner ved hjelp av melke-eddik-orcein11. Ved å kombinere disse metodene ble nukleinsyrer av høy kvalitet og kvantitet ekstrahert fra kjønnsbestemte embryoer, noe som ellers var vanskelig å etablere6. Den ekstraherte RNA ble brukt til neste generasjons sekvensering. Samlet gjelder metodene som presenteres her for andre lepidopteran insekter og andre insekt taxa.
Tortricid består av flere landbruks- og skogbruk skadedyr; Den nåværende studien presenterte metoder for å bake tortrix over generasjoner, observere embryogenese og kjønn av insekter, og gjennomføre molekylær analyse ved hjelp av modne embryoer.
En av hindringene for skadedyrsinsektstudie er å etablere oppdrettsmetoder. Spesielt påvirker innavl noen ganger artens kondisjon negativt. Kondisjonsreduksjonen ved innavl, kalt innavlsdepresjon, har blitt observert mye hos ulike planter og d…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Research Fellowships for Young Scientists [Grant Number 19J13123 og 21J00895].
1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |