Criação em massa e estudos moleculares em insetos de peste de Tortricidae
Summary
O presente protocolo descreve o método de criação de insetos de peste tortricida nos laboratórios. Os procedimentos para distinguir o sexo dos insetos e extrair ácidos nucleicos para sequenciamento de alto rendimento são estabelecidos usando duas pragas tortricidas.
Abstract
O tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais, que causam sérias perdas agrícolas. Para entender a biologia dessas mariposas de pragas, técnicas fundamentais têm sido de alta demanda. Aqui, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares são desenvolvidos usando duas tortrix de chá, Homona magnanima e Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Os insetos foram criados em massa com dieta artificial fatiada e mantidos pela endogamia por mais de 100 gerações, considerando suas características biológicas. Insetos têm vários dimorfismos sexuais; portanto, é difícil distinguir o sexo durante os estágios de desenvolvimento, que impediram ensaios subsequentes. O presente trabalho destacou que o sexo das larvas de tortricóides poderia ser determinado observando testículos ou coloração de orceina láctica-actic para visualizar o cromossomo W específico feminino. Além disso, utilizando os métodos de determinação sexual, o presente estudo possibilitou extrações de ácido nucleico a partir de embriões determinados por sexo e aplicação para sequenciamento de alto rendimento. Essas dicas são aplicáveis para outros insetos pragas e facilitarão estudos morfológicos e genéticos.
Introduction
Os insetos lepidopteranos representam mais de 10% de todas as espécies vivas descritas1, e certas espécies de taxas causam danos graves às plantas e graves perdas agrícolas 2,3. Embora estudos moleculares e genéticos tenham sido desenvolvidos usando insetos modelo, como o bicho-da-seda Bombyx mori 4,5, os insetos pragas permanecem sem investigação, em parte devido às dificuldades para criar e manusear 6,7. Portanto, estudos e técnicas fundamentais são necessários para entender a biologia desses insetos pestes não-modelo.
O Tortricidae (Lepidoptera), comumente conhecido como tortrix ou mariposas de rolo compressor, compreende muitas pragas agrícolas e florestais8. Da taxa de insetos, a tortrix oriental Homona magnanima Diakonoff e a tortrix de frutas de verão Adoxophyes honmai Yasuda são pragas polifagosas graves conhecidas por danificar árvores de chá no leste da Ásia7. As duas espécies estavam agrupamentos de ovos planos e ovais (ou massas de ovos) consistindo de ovos finos, macios e frágeis cobertos por secreções maternas. Embora os estágios de embriogênese sejam cruciais para o desenvolvimento de insetos e determinações sexuais9, as estruturas dos ovos impedem que uma análise mais aprofundada entenda a biologia dos insetos. É importante superar as dificuldades para um estudo mais aprofundado sobre pragas que oviposim essa complexa massa de ovos.
Aqui, para entender a biologia dos tortricídeos, métodos para criação em massa, observações e estudos moleculares foram desenvolvidos usando A. honmai e H. magnanima. Primeiro, os métodos de criação em massa mantêm os dois tortricídeos acima de 100 gerações por inserção. A separação dos ovos da massa de ovos em escala concatenada facilitou a observação embrigênese dos tortricídeos usando solventes alcalinos e orgânicos previamente desenvolvidos a partir de técnicas usadas em moscas10. Além disso, o presente estudo estabeleceu a discriminação sexual de pequenos embriões, desenvolvendo métodos de coloração da cromatina sexual de fêmeas lepidopteranas utilizando orceina láctica-acética11. Combinando esses métodos, ácidos nucleicos de alta qualidade e quantidade foram extraídos de embriões determinados por sexo, o que de outra forma era difícil de estabelecer6. O RNA extraído foi utilizado para sequenciamento de próxima geração. Coletivamente, os métodos aqui apresentados aplicam-se a outros insetos lepidopteranos e outros insetos taxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O tortrida compreende várias pragas agrícolas e florestais; o presente estudo apresentou métodos para retrocoterar ao longo de gerações, observar a embriogênese e o sexo dos insetos e realizar análises moleculares utilizando embriões maduros.
Um dos obstáculos para o estudo de insetos de pragas é estabelecer métodos de criação. Especialmente, a endogamia às vezes afeta negativamente a aptidão da espécie. A redução do condicionamento físico pelo inerido, chamada de depressão…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam reconhecer o apoio da Sociedade japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) Bolsas de Pesquisa para Jovens Cientistas [Grant Number 19J13123 e 21J00895].
Materials
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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