Ансамблевая силовая спектроскопия по силам сдвига
Summary
Ансамблевая силовая спектроскопия (EFS) является надежным методом механического разворачивания и зондирования в реальном времени ансамблевого набора биомолекулярных структур в биофизических и биосенсорных полях.
Abstract
Одномолекулярные методы, основанные на флуоресцентных и механохимических принципах, обеспечивают превосходную чувствительность в биологическом зондировании. Однако из-за отсутствия высоких пропускных возможностей применение этих методов ограничено в биофизике. Ансамблевая силовая спектроскопия (EFS) продемонстрировала высокую пропускную способность при исследовании массивного набора молекулярных структур путем преобразования механохимических исследований отдельных молекул в исследования молекулярных ансамблей. В этом протоколе вторичные структуры ДНК (i-мотивы) разворачивались в сдвиговом потоке между ротором и статором наконечника гомогенизатора со скоростью сдвига до 77796/с. Было продемонстрировано влияние скорости потока и размеров молекул на силы сдвига, испытываемые i-мотивом. Методика EFS также выявила сродство связывания между i-мотивами ДНК и лигандами. Кроме того, мы продемонстрировали химическую реакцию щелчка, которая может быть приведена в действие силой сдвига (т. Е. Химия механо-щелчка). Эти результаты устанавливают эффективность использования силы сдвига для контроля конформации молекулярных структур.
Introduction
В одномолекулярной силовой спектроскопии1 (SMFS) механические свойства отдельных молекулярных структур были изучены сложными инструментами, такими как атомно-силовой микроскоп, оптический пинцет и магнитный пинцет 2,3,4. Ограниченные одним и тем же требованием направленности молекул в силообразующих/детектирующих установках или малым полем зрения в магнитных пинцетах и миниатюрном центрифужном силовом микроскопе (MCF)5,6,7,8, только ограниченное количество молекул может быть исследовано одновременно с использованием SMFS. Низкая пропускная способность SMFS препятствует ее широкому применению в области молекулярного распознавания, что требует привлечения большого набора молекул.
Сдвиговой поток обеспечивает потенциальное решение для приложения сил к массивному набору молекул9. В потоке жидкости внутри канала, чем ближе к поверхности канала, тем медленнее скорость потока10. Такой градиент скорости потока вызывает напряжение сдвига, параллельное граничной поверхности. Когда молекула помещается в этот поток сдвига, молекула переориентируется так, что ее длинная ось выравнивается с направлением потока, поскольку сила сдвига прикладывается к длинной оси11. В результате этой переориентации ожидается, что все молекулы одного типа (размер и длина ручек) выровняются в одном направлении, испытывая при этом одинаковую силу сдвига.
Эта работа описывает протокол использования такого сдвигового потока для оказания силы сдвига на массивный набор молекулярных структур, примером чего является i-мотив ДНК. В этом протоколе между ротором и статором в наконечнике гомогенизатора генерируется сдвиговой поток. Настоящее исследование показало, что сложенная структура i-мотива ДНК может быть развернута со скоростью сдвига 9724-97245 s−1. Кроме того, между лигандом L2H2-4OTD и i-мотивом была обнаружена константа диссоциации 36 мкМ. Это значение согласуется с значением 31 мкМ, измеренным анализом сдвигагеля 12. Кроме того, современная техника используется для развертывания i-мотива, который может обнажить хелатную медь (I) для катализации реакции щелчка. Таким образом, этот протокол позволяет развернуть большой набор структур i-motif с недорогими инструментами за разумное время (менее 30 минут). Учитывая, что метод силы сдвига резко увеличивает пропускную способность силовой спектроскопии, мы называем эту технику ансамблевой силовой спектроскопией (EFS). Этот протокол направлен на предоставление экспериментальных руководящих принципов для облегчения применения этой EFS на основе сдвиговой силы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в этой рукописи, позволяет в режиме реального времени исследовать разворачивание ансамблевого набора биомолекулярных структур силой сдвига. Представленные здесь результаты подчеркивают, что структуры ДНК i-motif могут быть развернуты силой сдвига. Развертывание лиг…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта исследовательская работа была поддержана Национальным научным фондом [CBET-1904921] и Национальными институтами здравоохранения [NIH R01CA236350] для H. M.
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H. Single-molecule mechanochemical sensing. Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).
