Summary
Доклинические модели направлены на расширение знаний о биологии рака и прогнозирование эффективности лечения. В этой статье описывается генерация ксенотрансплантатов пациента (zPDX) на основе рыбок данио-рерио с фрагментами опухолевой ткани. Лечение zPDX проводили химиотерапией, терапевтический эффект которой оценивали с точки зрения клеточного апоптоза трансплантированной ткани.
Abstract
Рак является одной из основных причин смерти во всем мире, и заболеваемость многими видами рака продолжает расти. Значительный прогресс был достигнут с точки зрения скрининга, профилактики и лечения; Тем не менее, доклинические модели, которые предсказывают профиль химиочувствительности онкологических больных, все еще отсутствуют. Чтобы восполнить этот пробел, была разработана и проверена модель ксенотрансплантата, полученная от пациента in vivo . Модель была основана на эмбрионах рыбок данио-рерио (Danio rerio) через 2 дня после оплодотворения, которые использовались в качестве реципиентов ксенотрансплантатных фрагментов опухолевой ткани, взятых из хирургического образца пациента.
Также стоит отметить, что биоптические образцы не были переварены или дезагрегированы, чтобы сохранить микроокружение опухоли, что имеет решающее значение с точки зрения анализа поведения опухоли и ответа на терапию. В протоколе подробно описан метод получения ксенотрансплантатов пациента (zPDX) на основе рыбок данио-рерио после хирургической резекции первичной солидной опухоли. После скрининга у анатомопатолога образец препарируют с помощью лезвия скальпеля. Некротизированная ткань, сосуды или жировая ткань удаляются, а затем измельчаются на кусочки размером 0,3 мм x 0,3 мм x 0,3 мм.
Затем кусочки флуоресцентно маркируют и ксенотрансплантируют в перивителлиновое пространство эмбрионов рыбок данио. Большое количество эмбрионов может быть обработано с низкими затратами, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ in vivo химиочувствительности zPDX к нескольким противоопухолевым препаратам. Конфокальные изображения обычно получаются для обнаружения и количественной оценки уровней апоптоза, вызванных химиотерапией, по сравнению с контрольной группой. Процедура ксенотрансплантата имеет значительное преимущество во времени, поскольку она может быть завершена за один день, что обеспечивает разумное временное окно для проведения терапевтического скрининга для совместных клинических испытаний.
Introduction
Одна из проблем клинических исследований рака заключается в том, что рак – это не отдельное заболевание, а множество различных заболеваний, которые могут развиваться с течением времени, требуя специфических методов лечения в зависимости от особенностей самой опухолии пациента1. Следовательно, задача состоит в том, чтобы перейти к исследованиям рака, ориентированным на пациента, чтобы определить новые персонализированные стратегии для раннего прогнозирования результатов лечения рака2. Это особенно актуально для аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC), поскольку она считается трудно поддающимся лечению раком с 5-летней выживаемостью 11%3.
Поздняя диагностика, быстрое прогрессирование и отсутствие эффективных методов лечения остаются наиболее актуальными клиническими проблемами PDAC. Таким образом, основная задача состоит в том, чтобы смоделировать пациента и определить биомаркеры, которые могут быть применены в клинике, чтобы выбрать наиболее эффективную терапию в соответствии с персонализированной медициной 4,5,6. Со временем были предложены новые подходы к моделированию раковых заболеваний: органоиды, полученные от пациента (PDO), и ксенотрансплантаты, полученные от пациентов от мышей (mPDX), происходят из источника опухолевой ткани человека. Они были использованы для воспроизведения заболевания для изучения ответа и резистентности к терапии, а также рецидива заболевания 7,8,9.
Аналогичным образом, возрос интерес к моделям ксенотрансплантатов, полученных из пациентов (zPDX) на основе рыбок данио, благодаря их уникальным и многообещающим характеристикам10, представляющим собой быстрый и недорогой инструмент для исследования рака11,12. Модели zPDX требуют лишь небольшого размера выборки опухоли, что делает возможным высокопроизводительный скрининг химиотерапии13. Наиболее распространенный метод, используемый для моделей zPDX, основан на полном переваривании образца и имплантации первичных клеточных популяций, что частично воспроизводит опухоль, но имеет недостатки в виде отсутствия микроокружения опухоли и перекрестных помех между злокачественными и здоровыми клетками14.
Эта работа показывает, как zPDX могут быть использованы в качестве доклинической модели для определения профиля химиочувствительности пациентов с раком поджелудочной железы. Ценная стратегия облегчает процесс ксенотрансплантата, поскольку нет необходимости в расширении клеток, что позволяет ускорить химиотерапевтический скрининг. Сила модели заключается в том, что все компоненты микроокружения сохраняются в том виде, в каком они находятся в раковой ткани пациента, поскольку, как известно, поведение опухоли зависит от их взаимодействия15,16. Это очень выгодно по сравнению с альтернативными методами в литературе, поскольку можно сохранить гетерогенность опухоли и способствовать улучшению предсказуемости исхода лечения и рецидива в зависимости от конкретного пациента, что позволяет использовать модель zPDX в совместных клинических испытаниях. В этой рукописи описываются этапы, связанные с созданием модели zPDX, начиная с фрагмента резекции опухоли пациента и его лечения для анализа ответа на химиотерапию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Министерство здравоохранения Италии одобрило все описанные эксперименты на животных в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС об использовании животных и уходе за ними. Местный этический комитет одобрил исследование под регистрационным номером 70213. Информированное согласие было получено от всех вовлеченных субъектов. Перед запуском следует подготовить все растворы и оборудование (раздел 1) и скрестить рыбу (раздел 2).
1. Приготовление растворов и оборудования
ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 приведены решения и среды, которые необходимо подготовить.
- Агарозная гелевая поддержка
- Взвесьте порошок агарозы в колбе для микроволновой печи и растворите его в заданном объеме среды рыбок данио-рерио E3, чтобы получился 1% гель. Нагревайте в микроволновой печи до полного растворения агарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не перекипятите раствор. - Вылейте растопленную агарозу в чашку Петри и дождитесь, пока гель полностью застынет.
- Сделайте небольшие агарозные цилиндры (высотой ~5 мм) с помощью пластиковой пипетки Пастера с отрезанным наконечником. После приготовления хранить в чашке Петри при температуре 4 °C, завернутой в алюминиевую фольгу.
- Взвесьте порошок агарозы в колбе для микроволновой печи и растворите его в заданном объеме среды рыбок данио-рерио E3, чтобы получился 1% гель. Нагревайте в микроволновой печи до полного растворения агарозы.
- Стеклянные микроиглы
- Потяните за капилляры боросиликатного стекла с помощью съемника, чтобы получить тонкие иглы (настройки: HEAT 990, PULL 550).
ПРИМЕЧАНИЕ: Из одного капилляра можно получить две тонкие иглы с диаметром кончика 10 мкм.
- Потяните за капилляры боросиликатного стекла с помощью съемника, чтобы получить тонкие иглы (настройки: HEAT 990, PULL 550).
2. Скрещивание рыбы и сбор яиц
- Переведите взрослых рыб в резервуары для разведения за 3 дня до имплантации ткани, как описано Avdesh et al.17.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется соотношение мужчин и женщин 1:1 или 2:3. Плотность рыбы должна составлять максимум пять рыб на литр воды. Держите самцов и самок отдельно барьером на ночь.
- На следующий день снимите барьер и дайте рыбкам спариться.
- Извлеките рыбу из резервуаров для разведения и верните ее в резервуары для содержания.
- Вылейте воду из емкости для разведения через мелкоячеистую сетку. Переложите оплодотворенные яйца в чашку Петри со средой для рыбок данио-рерио E3.
- Проверьте чашку Петри стереомикроскопом и выбросьте мутные яйца. Храните оплодотворенные яйца в свежей среде для рыбок данио-рерио E3 при температуре 28 °C.
3. Сбор образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавные щипцы и ручка скальпеля.
- Немедленная обработка
- Соберите хирургический образец опухоли в 10 мл опухолевой среды при 4 ° C (образец опухоли от 5 мм до 10 мм в диаметре). Перенесите образец при температуре 4 °C из нужного места для немедленной обработки.
- Хранение на ночь (опционально)
- Соберите образец хирургической опухоли в 10 мл опухолевой среды и храните образец в течение ночи при температуре 4 ° C.
- Хранение при температуре -80 °C (опционально, не рекомендуется)
- Хранят образец при -80 °C в криогенном флаконе с опухолевой средой с добавлением 5% диметилсульфоксида (ДМСО).
4. Обработка образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги под вытяжкой ламинарного потока стерильной культуры тканей.
- Промойте всю опухолевую ткань 5 мл свежей опухолевой среды, пипеткой вверх и вниз 10 раз с помощью пластиковой пипетки Пастера. Аспирируйте и выбросьте моющее средство. Повторите этот шаг 3 раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте аспирации опухолевой ткани, так как она может оставаться прикрепленной к пластиковой пипетке Пастера. - Перенесите образец в чашку Петри и погрузите его в 1-2 мл свежей опухолевой среды. Разрезают образец опухоли на мелкие кусочки (1-2мм3) с помощью лезвия скальпеля и помещают их в стерильную пластиковую пробирку объемом 5 мл с опухолевой средой.
- Установите измельчитель тканей McIlwain на толщину 100 мкм. Поместите фрагменты образца на круглый пластиковый стол измельчителя и измельчите их. Поверните стол на 90° и повторите измельчение.
- Центрифугируют фрагменты при 300 × г в течение 3 мин. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и выбросьте ее.
- Инкубируйте фрагменты с помощью флуоресцентного трекера клеток, CM-DiI (конечная концентрация 10 мкг/мл в фосфатном буферном физиологическом растворе Dulbecco [DPBS]), Deep Red (конечная концентрация 1 мкл/мл в DPBS) или CellTrace (конечная концентрация 5 мкМ в DPBS) в течение 30 мин, помещая пробирку на водяную баню с температурой 37 °C.
- Ресуспендируйте фрагменты, осторожно пипетируя вверх и вниз каждые 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае CellTrace добавьте среду, содержащую не менее 1% белка, в конце инкубации в соответствии с инструкциями производителя. - Центрифугу при 300 х г в течение 3 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 3 раза с 1 мл DPBS, чтобы удалить неинкорпорированный краситель.
- Суспендировать фрагменты в 5 мл DPBS в чашке Петри диаметром 60 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы ткань не пересыхала.
5. Создание zPDX
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги под вытяжкой ламинарного потока стерильной культуры тканей.
- Анестезируют эмбрионы через 2 дня после оплодотворения (АКДФ) 0,16 мг / мл трикаина в среде рыбок данио-рерио E3.
- Поместите три агарозных цилиндра (шаг 1.1.3) в чашку Петри и положите эмбрион рыбки данио-рерио на цилиндр, обнажив одну сторону. Удалите излишки раствора, чтобы сохранить эмбрион в тонкой пленке.
- Перенесите кусочек окрашенной ткани стерильными щипцами из чашки Петри в 1%-ную агарозную подложку, где лежит эмбрион. Возьмите ткань, положите ее поверх желтка эмбриона, а затем протолкните ее в перивителлиновое пространство с помощью термовытянутой стеклянной микроиглы (шаг 1.2.1).
- Аккуратно добавьте несколько капель E3 1% пенициллин-стрептомицин (Pen-Strep) к эмбриону, чтобы вернуть его в жидкость.
- Повторите шаги 5.2-5.4 для всех эмбрионов и, наконец, снимите агарозные подложки с чашки Петри и инкубируйте эмбрионы при 35 ° C.
- Проверьте эмбрионы на наличие правильных ксенотрансплантатов (положительное окрашивание) через 2 ч после имплантации с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Отбрасывают эмбрионы с опухолевыми фрагментами, которые не полностью находятся внутри перивителлинового пространства, а также мертвые эмбрионы. Случайным образом распределите эмбрионы по шести многолуночным планшетам (максимум n = 20 эмбрионов в лунку), поровну разделенных на группы в соответствии с планом эксперимента (например, контрольная группа и FOLFOXIRI).
6. Лечение
- Разбавьте препарат (например, 5-фторурацил, оксалиплатин, иринотекан) в E3 1% Pen-Strep, тщательно перемешав, пипеткой вверх и вниз несколько раз. Как было предложено Usai et al.12, используют пятикратное разведение препарата в рыбной воде по отношению к эквивалентной концентрации в плазме (EPC).
- Смешайте препараты для приготовления коктейля (например, FOLFOXIRI).
- Извлеките носитель из каждой лунки и добавьте лекарственный коктейль через 2 ч после имплантации.
- Обрабатывайте эмбрионы в течение 3 дней. Обновляйте лекарственный коктейль каждый день.
7. Цельное иммунофлюоресцентное окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы поместите ацетон при -20 ° C и приготовьте растворы, перечисленные в таблице 1.
- День 1:
- Зафиксируйте личинки 1 мл 4% параформальдегида в стеклянных флаконах при температуре 4 ° C на ночь.
- День 2:
- Вымойте личинок 3 раза 5 мин 1 мл PBS, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
- Хранить в 1 мл 100% метанола при температуре -20 °C в течение ночи (или для длительного хранения).
- Регидратируйте 3 x 10 мин с 1 мл PTw (0,1% tween в PBS), осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
- Пермеабилизируют 1 мл 150 мМ Tris-HCl при рН 8,8 в течение 5 мин при RT с последующим нагреванием в течение 15 мин при 70 °C.
- Промывайте 2 раза 10 мин 1 мл PTw, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
- Промывайте 2 x 5 мин 1 мл dH2O, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
- Пермеабилизировать 1 мл ледяного ацетона в течение 20 мин при -20 °C.
- Промывайте 2 x 5 мин 1 мл dH2O, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
- Промыть 2 x 5 мин 1 мл PTw, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
- Инкубируют личинок в 1 мл блокирующего буфера в течение 3 ч при 4 °C, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
- Поместите личинок в луночные пластины, разделенные по группам следующим образом: 10 личинок в 50 мкл объема/лунка в 96-луночном планшете или 20 личинок в 100 мкл объема/лунки в 48-луночном планшете.
- Откажитесь от блокирующего буфера, инкубируйте личинки раствором первичных антител (например, расщепленной каспазой-3 кролика против человека, 1:250), разведенным в инкубационном буфере на ночь при 4 ° C в темноте, и осторожно покачайте на шейкере (400 об/мин). Рекомендуемые тома см. в шаге 7.2.11.
- День 3:
- Вымойте личинок последовательно 3 х 1 ч с 1 мл PBS-TS (10% козьей сыворотки, 1% Triton X-100 в PBS), а затем через 2 x 10 мин с 1 мл PBS-T (1% Triton X-100 в PBS) и 2 x 1 ч с 1 мл PBS-TS. При каждой стирке аккуратно перемешивайте пластины с личинками на шейкере (400 об/мин).
- Инкубируйте личинок с конъюгированными флуоресцентными красителями вторичными антителами (например, перекрестно-адсорбированным вторичным антителом козьего антикролика IgG [H+L], Alexa Fluor 647, 1:500) и 100 мкг/мл Hoechst 33258, разведенным в инкубационном буфере в темноте в течение ночи при 4 °C, при осторожном перемешивании на шейкере (400 об/мин). Рекомендуемые объемы раствора вторичных антител см. в шаге 7.2.11.
- День 4:
- Промыть 3 x 1 ч с 1 мл PBS-TS и 2 x 1 ч с 1 мл PTw при осторожном перемешивании на шейкере (400 об/мин).
- Создайте круговой слой эмали (толщиной ~0,5-1 мм) на предметных стеклах микроскопа. Дайте эмали высохнуть и поместите личинки в центр круглого слоя, обнажив сторону ксенотрансплантата.
- Высушите излишки раствора и установите на стекло покровное стекло водорастворимой нефлуоресцирующей монтажной средой.
8. Визуализация
- Получение изображений под конфокальной микроскопией с 40-кратным объективом. Используйте следующие параметры сбора данных: разрешение 1024 x 512 пикселей с шагом по оси Z 5 мкм.
9. Анализ апоптоза с помощью ImageJ
- Загрузите (Фиджи просто) программное обеспечение ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads) и откройте образ файла Z-stack (нажмите «Файл» | Открытый). Во всплывающем окне выберите Stack viewing/Hyperstack и нажмите OK.
- Наложите различные каналы, выбрав «Изображение» | Цвет | Сделайте композитный.
- Перетащите полосу Z в нижней части изображения, чтобы просмотреть изображение Z-стека и определить область ксенотрансплантата (клетки, которые являются положительными для флуоресцентного трекера клеток. См. шаг 4.5) в перивителлийном пространстве рыбок данио.
- Выберите инструмент «Точка» и подсчитайте количество апоптотических клеток человека (от положительного до флуоресцентного трекера клеток и расщепленной каспазы-3), как показано в дополнительном видео S1.
- Дважды щелкните значок Point Tool , измените счетчик и подсчитайте общее количество ядер клеток человека (ядер CM-DiI-положительных клеток).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает экспериментальный подход к установлению zPDX из первичной аденокарциномы поджелудочной железы человека. Образец опухоли собирали, измельчали и окрашивали с использованием флуоресцентного красителя, как описано в разделе протокола 4. Затем zPDX были успешно установлены путем имплантации фрагмента опухоли в перивителлиновое пространство 2 эмбрионов рыбок данио-рерио, как описано в разделе 5 протокола. Как описано в разделе 6 протокола, zPDX были дополнительно проверены для выявления профилей чувствительности к химиотерапии раковых клеток, полученных от пациента. Например, была протестирована комбинация химиотерапии FOLFOXIRI (5-фторурацил, фолиновая кислота, оксалиплатин и иринотекан), поскольку она используется в качестве химиотерапии первой линии при прогрессирующей аденокарциноме протоков поджелудочной железы и при метастатическом колоректальном раке. Изображения zPDX были получены в виде Z-стеков на конфокальном микроскопе, а индукция апоптоза была проанализирована, как описано в разделах 8 и 9 протокола. Как показано на рисунке 1А,В, комбинированная терапия приводила к увеличению апоптоза клеток по сравнению с контрольной группой. В тематическом исследовании, представленном здесь, было выявлено статистически значимое увеличение доли апоптотических клеток в имплантированных ксенотрансплантатах для группы, получавшей FOLFOXIRI, по сравнению с контрольной группой (рис. 1C).
| Рисунок 1: zPDX из аденокарциномы протоков поджелудочной железы человека через 3 дня после лечения FOLFOXIRI. Клеточные мембраны окрашивали CM-DiI (красный), а ткань ксенотрансплантировали в перивителлиновое пространство 2 dpf AB рыбок данио-рерио дикого типа. Личинки подвергались воздействию комбинации FOLFOXIRI (0,216 мг / мл 5-фторурацила, 0,013 мг / мл фолиновой кислоты, 0,006 мг / мл оксалиплатина, 0,011 мг / мл иринотекана) или не подвергались воздействию (CTRL) в течение 3 дней, фиксировались и иммуноокрашивались расщепленным антителом каспазы-3 (голубой) и контрокрашивались Хёхстом (синие ядра). Личинки были смонтированы с помощью Aqua Poly-Mount в предметных стеклах микроскопа. (А1-3) Репрезентативный пример контрольной личинки (не подвергавшейся химиотерапии). Расщепленных каспазо-3-положительных клеток не наблюдалось. (В1-3) Репрезентативный пример ксенотрансплантированной личинки через 3 дня после обработки FOLFOXIRI, демонстрирующий последовательную активацию расщепленной каспазы-3. Снимки с цельным креплением были получены на конфокальный микроскоп Nikon A1 с цифровой камерой. Пунктирными линиями показаны области ксенотрансплантата. (C) Количественная оценка расщепленных двойных положительных клеток каспазы-3 и CM-DiI у ксенотрансплантированных личинок, обработанных FOLFOXIRI, по сравнению с CTRL, построенным как среднее значение ± SEM (n ≥ 12); p < 0,001, U-критерий Манна-Уитни. Масштабные линейки = 100 мкм. Сокращения: zPDX = ксенотрансплантат, полученный от пациента рыбок данио; DPF = дни после оплодотворения; FOLFOXIRI = 5-фторурацил, фолиновая кислота, оксалиплатин и иринотекан; CTRL = элемент управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. |
| Раствор/среда | Сочинение, комментарии | Цель | ||
| Опухолевая среда (1x) | К среде RPMI-1640 добавляют пенициллин-стрептомицин (конечная концентрация 100 ЕД/мл) и амфотерицин (конечная концентрация 2,50 мкг/мл). | |||
| Рыбки данио-рерио E3 средние (1x) | Разбавьте 60-кратную среду эмбриона E3 (NaCl 3 M, KCl 0,1 M, CaCl 2 0,2 M, MgSO4 0,2 M) в деионизированной воде до конечной рабочей концентрации 1x. | |||
| E3 1% Pen-Strep | Добавьте 1 мл пенициллина-стрептомицина к 99 мл среды E3 для рыбок данио. Смешайте инверсией. Хранить раствор при температуре 4 °C | |||
| PTw | 0,1% Tween в PBS | Цельное иммуноокрашивание | ||
| Блокировка буфера | 10% козьей сыворотки, 1% ДМСО, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 в PTw | Цельное иммуноокрашивание | ||
| Инкубационный буфер | 1% козьей сыворотки, 1% ДМСО, 1% BSA, 0,8% Triton X-100 в PTw | Цельное иммуноокрашивание | ||
| ПБС-ТС | 10% козьей сыворотки, 1% Triton X-100 в PBS | Цельное иммуноокрашивание | ||
| ПБС-Т | 1% Triton X-100 в PBS | Цельное иммуноокрашивание | ||
Таблица 1: Решения и носители, используемые в протоколе.
Дополнительный рисунок S1: Образец опухоли PDAC был окрашен в зеленый цвет и ксенотрансплантирован в перивителлиновое пространство 2 эмбрионов рыбок данио-рерио. После 3-дневного инкубационного периода zPDX вводили 2 мкг/мл йодида пропидия (PI; красный), а затем подвергали 3D-конфокальной визуализации. Жизнеспособность клеток проверяли путем измерения PI-положительных клеток из общего числа клеток человека (DiO-положительных). Масштабная линейка = 100 мкм. Сокращения: PDAC = аденокарцинома протоков поджелудочной железы; DPF = дни после оплодотворения; zPDX = ксенотрансплантат, полученный от пациента рыбок данио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео S1: Пример апоптотического подсчета клеток человека с использованием многоточечного инструмента ImageJ. Видео представляет собой Z-стек zPDX через 3 дня после имплантации, полученный после расщепления каспазы-3 и иммуноокрашивания Hoechst 33258. Сокращения: zPDX = ксенотрансплантат, полученный от пациента рыбок данио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модели in vivo в исследованиях рака предоставляют бесценные инструменты для понимания биологии рака и прогнозирования ответа на лечение рака. В настоящее время доступны различные модели in vivo , например, генетически модифицированные животные (трансгенные и нокаутные мыши) или ксенотрансплантаты, полученные пациентами из первичных клеток человека. Несмотря на множество оптимальных функций, каждый из них имеет различные ограничения. В частности, в вышеупомянутых моделях отсутствует надежный способ имитировать микроокружение опухолевой ткани пациента.
Было высказано предположение, что микроокружение опухоли может играть много важных ролей в ответе на лекарственное средство18. Поэтому, чтобы найти подходящую модель на животных, которая поддерживает микроокружение опухолевой ткани, была разработана альтернативная модель PDX с использованием кусочков ксенотрансплантата опухолевой ткани, привитых 2 эмбрионам рыбок данио-рерио. Протокол описывает, как выполнять ксенотрансплантаты в большом количестве эмбрионов, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг лекарств, как в виде отдельных агентов, так и в комбинациях.
Ключевым моментом этого инновационного подхода является то, что он сохраняет как межклеточные взаимодействия, так и микроокружение опухоли по сравнению с обычно выполняемыми zPDX с одноклеточными суспензиями. PDAC из хирургического образца немедленно помещают в свежую и холодную опухолевую среду, а опухоль измельчают на мелкие фрагменты. Общая процедура, используемая для создания модели zPDX, основана на прямой имплантации фрагмента опухоли пациента в перивителлиновое пространство эмбриона рыбок данио-рерио 2 dpf.
Предложенная модель может служить альтернативой модели PDX, основанной на переваривании образца опухолевой ткани, полученного пациентом, с последующей прямой инъекцией в желточный мешок или в перивителлиновое пространство. Как свидетельствует работа Fior et al., можно создать модель zAvatar из ферментативного вскрытия хирургически резецированных раков поджелудочной железы. Частота имплантации варьировала от 44% до 64% из-за типичной низкой клеточности опухолевого образца поджелудочной железы и неблагоприятной плотной десмопластической стромы19.
Однако клеточная суспензия лишь частично воспроизводила исходную опухоль14. И наоборот, mPDX, построенный путем прямой трансплантации опухолевой ткани иммунодефицитным мышам, лучше всего напоминает исходную опухоль, что может лучше помочь клиницистам понять поведение опухоли и оценить индивидуальные реакции до начала лечения20. Фактически, маленький привитый фрагмент поддерживает микроокружение опухоли и сохраняет перекрестные помехи между злокачественными и здоровыми клетками, подобно исходной опухоли21. Таким образом, химиочувствительность или химиорезистентность воспроизводятся лучше, что напрямую влияет на технологию zPDX в области трансляционной онкологии14. Подход zPDX позволяет каждому пациенту иметь свою собственную опухоль, развитую в живой системе. Таким образом, это представляет собой хорошую альтернативу использованию mPDX, когда опухолевая ткань ортотрансплантируется неповрежденной или дезагрегируется в клетках, которые затем ксенотрансплантируются в мышиные модели-реципиенты13.
Этот протокол был разработан в сотрудничестве с патологоанатомами, которые отвечают за выбор наиболее подходящих частей опухоли для трансплантации. Биологические образцы тканей всегда брались из хирургического образца, а не из биопсии, поскольку последняя обычно характеризуется дефицитом ткани и поэтому предназначена только для диагностических целей. Критерием отбора проб тканей обычно является не маргинальная по сравнению с ядром, а скорее область опухоли, лишенная кровоизлияния и некроза. По этой причине на одной половине образца всегда выполнялся криостатный гистологический срез для немедленного контроля качества материала. Настоящее исследование может быть ограничено способностью первичных опухолевых клеток приживаться в перивителлиновое пространство эмбрионов рыбок данио. Тем не менее, 80% приживление жизнеспособной ткани наблюдалось через 3 дня после трансплантации, как после хранения при 4 ° C (12/15 случаев), так и после размораживания при -80 ° C (10/12 случаев), что позволяет предположить, что опухоль может быть эффективно криоконсервирована с жизнеспособностью клеток 74% ± 2% (дополнительный рисунок S1). Несмотря на это, вероятность успешного приживления тканей варьируется между различными опухолями пациентов с PDAC; Следовательно, быстрая обработка ткани вскоре после хирургической резекции, а также предотвращение замораживания могут повысить эффективность.
В протоколе также предлагаются некоторые технические приемы для успешных ксенотрансплантатов. Например, использование измельчителя стандартизировало размеры ксенотрансплантированных деталей. Чтобы проверить, что кусочки опухолевых тканей равны по размеру после измельчения, потенциальным решением является использование калибровочного стекла для измерения диаметра фрагментов перед ксенотрансплантацией.
Использование 1% агарозного цилиндра необходимо как для укладки эмбрионов на одну сторону, так и для простой имплантации кусочка опухоли, а также для предотвращения поломки микроиглы. Поскольку опухоли демонстрируют высокую вариабельность, еще одним ограничением метода является то, что внутриопухолевая гетерогенность менее представлена во фрагменте по сравнению с клеточной суспензией. На самом деле, небольшие кусочки ткани могут расходиться с точки зрения доброкачественных клеточных популяций и опухолевых субклонов. Чтобы преодолеть эту критику, следует использовать большое количество инъецированных эмбрионов для повторения гетерогенности опухоли и уменьшения вариабельности анализа. Согласно статистическому анализу, каждой группе требуется размер выборки более 15, учитывая величину эффекта d = 2 и степень статистической значимости 80% и 95%. Это число разумно, так как опытный оператор может обрабатывать около 40 эмбрионов в час.
В дополнение к методологии, использованной для создания модели zPDX, здесь также было доказано, что комбинация FOLFOXIRI индуцирует апоптоз клеток, полученных от пациента, в модели zPDX. Как и в случае с FOLFOXIRI, можно проверить химиочувствительность zPDX к другим схемам химиотерапии, таким как те, которые успешно протестированы Usai et al.11.
Кроме того, представлена методика комплексного иммуноокрашивания и визуализации для количественной оценки интересующего признака. Чтобы преодолеть некоторые проблемы и привести к успешному иммунному окрашиванию целиком, рекомендуется 5% раствор ДМСО для проникновения в ткани. Что касается конфокальной визуализации, ограничения разрешения конфокального микроскопа могут ухудшить получение более глубоких стеков ксенотрансплантированных личинок. Однако в исследовании апоптотические клетки подсчитываются из общего числа клеток пациента. Трехмерная реконструкция от основания до вершины имплантированной опухолевой массы с шагом 5 мкм позволяет идентифицировать все ядра человека, учитывая вероятность того, что одно и то же ядро может распространяться в пределах предыдущей или следующей Z-плоскости. Следовательно, многоточечный счетчик инструментов ImageJ может использоваться для контроля и предотвращения двойного подсчета одной и той же клетки, а также для двойного подсчета в одних и тех же Z-стеках (апоптотический из общего количества клеток человека) и может легко отслеживать апоптоз на уровне одной клетки.
Несмотря на свои ограничения, модель zPDX имеет ряд преимуществ по сравнению с моделями in vivo : чрезвычайно быстрый жизненный цикл рыбок данио, способный получать большое количество животных за короткое время; оптическая прозрачность на этапах разработки; и, прежде всего, крайне низкое этическое воздействие в период с 0 до 120 часов после оплодотворения22. Сегодня совместное клиническое исследование с использованием zPDX дешевле, чем исследование, проводимое с PDX на основе мышей, поскольку иммунодефицитные штаммы-хозяева требуют высоких затрат на обслуживание, а также сложных методов визуализации для мониторинга роста опухоли23. В заключение, все эти факторы подчеркивают потенциал модели zPDX для использования в коклинических испытаниях для прогнозирования профилей чувствительности к химиотерапии онкологических больных и для использования исследователями, заинтересованными в новых моделях для скрининга лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Фондом Пизы (проект 114/16). Авторы хотели бы поблагодарить Раффаэле Гаэту из отделения гистопатологии Azienda Ospedaliera Pisana за отбор образцов пациентов и поддержку патологии. Мы также благодарим Алессию Галанте за техническую поддержку в экспериментах. Эта статья основана на работе COST Action TRANSPAN, CA21116, при поддержке COST (Европейское сотрудничество в области науки и техники).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
References
- Rubin, H.
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
