Her beskriver vi en metode for å generere glioblastom (GBM) organoider fra primære pasientprøver eller pasientavledede cellekulturer og opprettholde dem til modenhet. Disse GBM-organoidene inneholder fenotypisk forskjellige cellepopulasjoner og gjenskaper tumormikromiljøer ex vivo.
Glioblastom (GBM) er den hyppigst forekommende primære maligne hjernekreftformen med ekstremt dårlig prognose. Intratumoralt cellulært og molekylært mangfold, samt komplekse interaksjoner mellom tumormikromiljøer, kan gjøre det vanskelig å finne effektive behandlinger. Tradisjonelle tilhenger- eller sfærekulturmetoder kan maskere slike kompleksiteter, mens tredimensjonal organoidkultur kan rekapitulere regionale mikromiljøgradienter. Organoider er en metode for tredimensjonal GBM-kultur som bedre etterligner pasienttumorarkitektur, inneholder fenotypisk forskjellige cellepopulasjoner, og kan brukes til eksperimenter med middels gjennomstrømning. Selv om tredimensjonal organoidkultur er mer arbeidskrevende og tidkrevende sammenlignet med tradisjonell kultur, gir den unike fordeler og kan tjene til å bygge bro over gapet mellom nåværende in vitro og in vivo systemer. Organoider har etablert seg som uvurderlige verktøy i arsenalet til kreftbiologer for bedre å forstå tumoradferd og resistensmekanismer, og deres applikasjoner fortsetter bare å vokse. Her er det gitt detaljer om metoder for generering og vedlikehold av GBM-organoider. Instruksjoner om hvordan man utfører organoidprøveinnbygging og seksjonering ved hjelp av både frosne og parafininnbyggingsteknikker, samt anbefalinger for immunhistokjemi og immunfluorescensprotokoller på organoidseksjoner, og måling av total organoid celle levedyktighet, er også beskrevet.
Glioblastom (GBM) er den hyppigst forekommende primære hjernesvulsten med en dyster prognose på ca. 15 måneder fra diagnose1. Behandlinger som er effektive i prekliniske studier kan ofte være dårlig effektive hos pasienter 2,3. Dårlig klinisk respons tilskrives mange faktorer, inkludert mikromiljømessig heterogenitet av GBM og komplekse intratumorale interaksjoner. Disse kan være vanskelige å gjenskape i laboratoriemiljøet med tradisjonelle tilhenger- eller kulekulturmetoder4. Tilstedeværelsen av en undergruppe av selvfornyende kreftstamceller (CSC) innenfor GBM kan også bidra til denne kompleksiteten 5,6. CSC er avgjørende for tumorutbredelse og opprettholder tumorvekst ved å fremme aktiv angiogenese, kreftinvasjon og motstand mot terapier, inkludert stråling 7,8,9. CSC er ikke jevnt fordelt gjennom svulster, men er beriket innenfor spesifikke mikromiljøer, inkludert perivaskulær nisje og perinekrotiske regioner, som hver gir distinkt molekylær regulering av deres cellulære tilstander 10,11,12,13,14. CSC-er er ikke passive mottakere av mikromiljøsignaler, men har i stedet muligheten til å ombygge sine egne mikromiljøer 7,15,16. Mikromiljøet til en CSC kan fremme vedlikehold av stamcelletilstand som svar på press som næringsmangel, pH og hypoksi17,18,19,20, noe som tyder på viktigheten av disse forholdene i et modellsystem. Rekapitulering av det mangfoldige cellulære mikromiljøet i svulster er derfor avgjørende for å forstå terapeutisk motstand og identifisere nye terapier.
Tredimensjonal kultur har økt i popularitet de siste årene21,22. Organoider har blitt brukt i andre typer kreft, og det primære målet med å opprettholde celler som organoider er å tillate vekst av heterogene cellepopulasjoner (hvorav mange normalt kan utkonkurreres i mer homogen sfærekultur) og romlig mangfold, sett på som regionale tumormikromiljøer med genetisk spesifisitet 4,23,24,25,26 . Det finnes mange metoder for tredimensjonal kultur av kreftceller, som hver har fordeler og ulemper27,28,29. Organoidkultur er ikke ment å være en erstatning for tradisjonell tilhenger- eller sfærekultur. Det brukes best som en komplementær teknikk til todimensjonale metoder når det er spesifikke spørsmål der samspillet mellom cellemikromiljø og tumorcelleresponser er kritisk.
Denne artikkelen beskriver pålitelige og repeterbare metoder for å generere GBM-organoider fra enten primære pasientprøver eller pasientavledede kulturer. Vi tar for oss to ulike mål for tredimensjonal organoidkultur: (1) etablering av organoider fra primærpasientvev, med maksimalt transplanteringspotensial uavhengig av ensartethet, eller (2) dyrking av ensartede organoider for mer kvantitativ eksperimentell bruk. Når du etablerer en primærprøve som organoider, er det ikke nødvendig å filtrere for enkeltceller eller telle celler, fordi det er en prioritet å holde maksimale celletall og typer for å etablere den opprinnelige kulturen. Ved dyrking av organoider for komparative eksperimenter er det imidlertid nødvendig med enkeltcellefiltrering og celletelling for å sikre at replikasjonsorganoider er sammenlignbare for eksperimentell konsistens. Denne protokollen beskriver hvordan man etablerer organoidkulturer og skaper ensartede organoider, samt raffinerte metoder for innebygging og bevaring av organoider og standard cellekultureksperimenter, inkludert immunhistokjemi, immunfluorescens og vurdering av total celle levedyktighet i GBM-organoider.
GBM-organoider er en komplementær kulturmetode til tradisjonelle sfærer som inkluderer større cellulær og mikromiljømessig heterogenitet 4,22,30. Selv om det er mer tid og ressurskrevende, kan organoidkultur gi verdifull innsikt i intratumoral oppførsel og mekanismer for stoffresistens.
GBM er drevet av en befolkning på CSCs 5,31, og disse metodene ble utviklet for å tillate fortsatt vekst og selvfornyelse av denne CSC-befolkningen. Epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblast vekstfaktor (FGF) er kjent for å forbedre stamcelle vedlikehold og vekst og gi aktiv reseptor tyrosinkinase (RTK) signalering. Dannelsen av heterogene cellulære populasjoner og distinkte tumormikromiljøer i GBM-svulster er avhengig av å støtte CSC-atferd. Valget av en lrECM etterligner det lamininrike hjernemiljøet og støtter cellene i organoidkulturen til selvorganisering og migrering ved invasjon. Selv om noen grupper har etablert organoidkultur uten bruk av en lrECM eller EGF / FGF-beriket media24,28, som kan tilby en mer tidseffektiv måte av denne kulturmetoden og sterkere utvalg av onkogen signalering for å drive vekst, ble disse metodene valgt for å optimalisere pro-stamcellemiljøet for best å etablere den cellulære heterogeniteten til organoider. Både cerebrale organoider og GBM-organoider er laget med lrECM i litteraturen tidligere 21,32,33. Selv om vi har etablert data om tumorpopulasjonene som finnes i organoider og den romlige variasjonen, er mindre kjent om ikke-tumorpopulasjoner i organoider og hvor lenge de overlever fra de opprinnelige pasientprøvene. Visse IHC-flekker (for eksempel CD45) kan gi disse dataene, og kan være et interessant forskningspunkt i fremtiden med organoider.
Å vite den tiltenkte bruken for organoidkultur er viktig for å velge passende metoder. Etablering av organoider fra primære prøver versus voksende ensartede organoider for spesifikke eksperimenter har litt forskjellige prosedyrer. Å ha en forståelse for hvordan organoider modnes og visuelt fyller ut lrECM-stillaset er viktig for å kunne tildele riktig tid og ressurser til organoidkultur. Sparsomme områder av celler i organoider vil sakte utvide og vokse for å fylle lrECM, som kan ta alt fra 2-8 uker, avhengig av prøvens oppførsel. Denne veksthastigheten er noe iboende for hvert eksemplar; Den er bevart på tvers av forskjellige grupper av organoider og ganske konsistent med den relative frekvensen av sfærevekst. Organoider kan opprettholdes i over 1 år og beholde tumordannelsesevner på xenograft til mus; Det anbefales imidlertid å dyrke dem med et tydelig formål for ikke å kaste bort laboratorieressurser (både materialer og tid)4. Organoidvekst er testet i flere brønnstørrelser og formater, og viser at en 10 cm plate er den ideelle innstillingen for å opprettholde optimal celle levedyktighet, etterfulgt av en 6-brønns plate med tre organoider per brønn34. Organoider bruker mer media sammenlignet med sine todimensjonale kulturmodeller, og bruk av et mindre brønnformat fører ikke til riktig vedlikehold. For eksempel har en brønn av en 96-brønns formatplate ikke nok plass eller medievolum i forhold til størrelsen på en organoid for å opprettholde organoidvekst.
Som organoider etablerer, er det viktig å være observant for å øke suksessen. I utgangspunktet vil organoider konsumere media sakte, men etter hvert som de blir tettere og mer modne, vil de konsumere media raskere. Tilsetning av fenolrødt til mediet kan bidra til å tjene som en indikator på medieforbruk. Når mediet er mer gult, kan det be oss om å justere fôringsmønsteret, enten det er å bytte et høyere volum av medier, øke den totale mediemengden i platen, dele organoider blant flere cellekulturplater for å holde tritt med veksten, eller til og med justere tidslinjen for eksperimenter.
På mange måter er organoider en ineffektiv måte å drive kreftforskning på. De involverer lange tidsskalaer, og er dyre og ressurstunge sammenlignet med GBM-sfærekultur. Men sammenlignet med pasientavledede xenotransplantater, en alternativ metode for å gjenskape cellulært og mikromiljømessig mangfold, er de enklere, billigere og kontrollerbare. Valg av når organoider best skal brukes er viktig for kreftforskere. De er ikke ment å erstatte tradisjonell sfære eller tilhengerkultur og ikke å erstatte xenograftmodeller. Organoider kan, når de brukes på riktig vitenskapelig spørsmål, kombinere fordelene med begge disse systemene og kan tillate oss å observere tumorcellebiologi som ellers ville forbli skjult. Det vitenskapelige samfunnet begynner bare å forstå hvilke læringsmuligheter organoider tilbyr, men det er klart at de vil være et uvurderlig verktøy i fremtiden for å forstå GBMs komplekse biologi.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. Justin Lathia for hans uvurderlige råd og løpende støtte. Vi takker også Katrina Fife, Lisa Wallace og Maya Camhi for deres utmerkede tekniske støtte.
3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Normal donkey serum (NDS) |
Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
Phenol red | Sigma | P0290 | Phenol red (0.5%) |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P10144 | Liquid curing mountant |
Recombinant human EGF protein | R&D systems | 236-EG-01M | Recombinant human EGF protein (250 µg/mL) |
Recombinant human FGF basic | R&D systems | 4144-TC-01 | Recombinant human FGF basic (250 µg/mL) |
SignalStain Antibody Diluent | Cell Signaling | 8112 | Antibody diluent |
SignalStain Boost IHC Detection Reagent | Cell Signaling | 8114 | Immunohistochemistry detection reagent |
SignalStain Citrate Unmasking Solution | Cell Signaling | 14746 | Citrate unmasking solution |
Single edge razor blade | Uline | H-595B | Single edge razor blade |
Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360070 | Sodium pyruvate (100 mM) |
Tissue-Tek Cryomolds | VWR | 25608-916 | Disposable cryomolds |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Optimal cutting temperature compound |
Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | T10282 | Cell impermeant stain (0.4%) |
Xylene | ThermoFisher Scientific | X3P-1GAL | Xylene |