エンテロイド由来単分子膜を用いた早産小腸障害および治癒の in vitro モデルに対するヒアルロン酸35 kDaの効果
Summary
このプロトコルは、非ヒト霊長類回腸から単離された3次元(3D)エンテロイドに由来する2次元(2D)単層上で引っかき傷アッセイを確立して実行する方法を記載する。
Abstract
in vitro 引っ掻き傷創傷アッセイは、さまざまな組織タイプにおける上皮治癒のメカニズムと特性を調査するために一般的に使用されます。ここでは、回腸末端の腸管陰窩に由来する3次元(3D)非ヒト霊長類エンテロイドから2次元(2D)単層を生成するプロトコルを記載する。次に、これらのエンテロイド由来の単分子膜を in vitro スクラッチ創傷アッセイで利用して、母乳HA模倣体であるヒアルロナン35 kDa(HA35)が上皮創傷縁に沿った細胞移動と増殖を促進する能力をテストしました。単層をコンフルエントに成長させた後、手動で引っ掻き、HA35(50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)またはコントロール(PBS)で処理しました。ギャップへの細胞移動および増殖は、生細胞イメージング用に装備された透過光顕微鏡を用いてイメージングした。創傷閉鎖は、ImageJの創傷治癒サイズプラグインを使用して創傷治癒率として定量化された。スクラッチ領域および細胞移動速度および創傷閉鎖の割合を24時間にわたって測定した。 in vitro でのHA35は、おそらく創傷端での細胞増殖および創傷領域への移動の組み合わせを通じて、小腸腸単層の創傷治癒を促進する。これらの方法は、早産のヒト小腸における腸管再生を探索するためのモデルとして潜在的に使用することができる。
Introduction
壊死性腸炎(NEC)は、早産児の最も一般的な胃腸緊急事態の1つです1。この疾患は、腸壊死、敗血症、および潜在的に死に至る可能性のある重度の腸の炎症を特徴としています。病因は不明ですが、証拠はNECが多因子性であり、摂食、異常な細菌コロニー形成、および未熟な腸上皮の複雑な相互作用の結果であることを示唆しています2,3。早産児は、腸透過性の増加、異常な細菌コロニー形成、および低い腸細胞再生能力4,5を有し、腸管バリア機能障害、細菌転座、およびNEC発症のリスクを高めます。したがって、腸上皮の成熟を促進し、腸上皮の再生または治癒を促進するための戦略または介入を特定することは、この致命的な病気を予防する上で重要です。
研究によると、母乳(HM)は早産児のNECに対して保護的であることが示されています6、7、8、9、10、11。ヒトと動物の両方の研究は、ウシベースの処方が腸透過性を増加させ、腸上皮細胞に直接毒性があることを示しました2,12。完全には解明されていませんが、HMの保護効果は、ラクトフェリン、免疫グロブリンA(IgA)、HMオリゴ糖などの生理活性成分を介して媒介されることを示唆する証拠があります13。HMはまた、D-グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミン二糖を繰り返す独特の非硫酸化グリコサミノグリカンであるヒアルロナン(HA)も豊富です14,15。重要なことに、マウスNEC様腸損傷モデルにおいて、HM HA模倣体である経口35 kDaHA(HA35)が腸損傷の重症度を減弱させ、細菌の転座を防ぎ、死亡率を低下させることを示した16,17。
ここでは、in vitroでの腸の治癒と再生に対するHA35の効果をさらに調査します。現在、腸の創傷および修復のために最も広く使用されているin vitroアッセイは、結腸直腸癌(CRC)細胞単層において行われる引っかき傷アッセイである。CRC細胞の創傷修復は、幹細胞駆動の修復プロセスではなく、癌細胞の高度に増殖する性質に大きく依存しているため、早産児腸に対するそのようなモデルの生理学的関連性は限られています18。この制限を克服するために、早産の非ヒト霊長類(NHP)から初代幹細胞由来の小腸エンテロイドを単離および維持する手順を含む、2D腸介スクラッチ創傷モデルの確立をここで説明する。早産NECが遠位小腸で最も頻繁に報告されていることを考えると、腸の損傷と修復のモデルにおける初代上皮細胞オルガノイドの使用は、従来の結腸直腸単分子膜を利用する既存のモデルと比較して、より生理学的に翻訳可能なin vitroモデルを提供します18,19。
Protocol
この研究のすべての動物の手順は、オクラホマ大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会によって承認されました。施設の承認に続いて、早産の非ヒト霊長類(NHP、妊娠90%、オリーブヒヒ、 パピオアヌビス)からの胎児小腸便宜サンプルが、別の研究のために安楽死後に取得されました(プロトコル#101523-16-039-I)20。 1. 早産非ヒト霊…
Representative Results
さまざまな組織や臓器の組織修復と創傷治癒に対するHAの影響は十分に文書化されています。ただし、胎児または新生児の小腸の治癒と再生に対する分子量35 kDaのHAの具体的な影響は現在不明です。.胎児または新生児の小腸のモデルでHA35が創傷治癒を促進する能力をテストするために、NHP回腸組織から3D腸管エンテロイドを生成し、さらにこの組織を単一細胞に解離させて2Dエンテロイド由来…
Discussion
早産児の胃腸管は、嚥下障害、炎症性細菌代謝物および毒素、および断続的低酸素症に関連する環境侮辱への繰り返し曝露による継続的な再生圧力下にあります23,24。残念ながら、早産児の腸上皮は機能的完全性を迅速に確立することができず23、バリア機能障害、腸透過性の増加、そして重症の場合、横行する腸の炎症とNECの発?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。HCは、国立衛生研究所からの助成金P20GM134973によってサポートされています。KBは、小児病院財団(CHF)と長老派健康財団(PHF)の助成金によってサポートされています。Cancer Functional Genomicsコアが提供する生細胞イメージングサービスは、オクラホマ大学健康科学センタースティーブンソンがんセンターに授与された国立総合医学研究所の助成金P20GM103639および国立がん研究所の助成金P30CA225520によって部分的にサポートされました。
Materials
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
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Cite This Article
Wilson, A., Burge, K., Eckert, J., Chaaban, H. Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers. J. Vis. Exp. (185), e63758, doi:10.3791/63758 (2022).