Un modèle hépatocytaire compétent examinant l’entrée du virus de l’hépatite B par le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium comme cible thérapeutique

Summary

Nous présentons un protocole pour dépister les composés anti-virus de l’hépatite B (VHB) ciblant les étapes du cycle de vie d’entrée pré et post-virale, en utilisant la calorimétrie de titrage isotherme pour mesurer l’affinité de liaison (K_D) avec le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium de l’hôte. L’efficacité antivirale a été déterminée par la suppression des marqueurs du cycle de vie viral (formation d’ADNcc, transcription et assemblage viral).

Abstract

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) a été considérée comme un facteur de risque crucial pour le carcinome hépatocellulaire. Le traitement actuel ne peut que réduire la charge virale, mais n’entraîne pas de rémission complète. Un modèle hépatocytes efficace pour l’infection par le VHB offrirait un cycle de vie viral réaliste qui serait crucial pour le dépistage des agents thérapeutiques. La plupart des agents anti-VHB disponibles ciblent les étapes du cycle de vie après l’entrée virale, mais pas avant l’entrée virale. Ce protocole détaille la génération d’un modèle d’hépatocytes compétent capable de dépister des agents thérapeutiques ciblant les étapes du cycle de vie de l’entrée prévirale et post-entrée virale. Cela comprend le ciblage de la liaison au polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium (NTCP), la formation d’ADNCC, la transcription et l’assemblage viral basés sur l’imHC ou l’HepaRG en tant que cellules hôtes. Ici, le test d’inhibition de l’entrée du VHB a utilisé la curcumine pour inhiber les fonctions de liaison et de transport du VHB via NTCP. L’affinité de liaison (K_D) avec le PNCB avec le PNCB a été évaluée à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), un outil universel pour le dépistage des médicaments contre le VHB basé sur des paramètres thermodynamiques.

Introduction

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est considérée comme une maladie potentiellement mortelle dans le monde entier. L’infection chronique par le VHB est chargée d’un risque de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire¹. Le traitement anti-VHB actuel se concentre principalement sur l’entrée post-virale à l’aide d’analogues nucléos(t)ide (NA) et d’interféron alpha (IFN-α)^2,3. La découverte d’un inhibiteur de l’entrée du VHB, Myrcludex B, a permis d’identifier une nouvelle cible pour les agents anti-VHB⁴. La combinaison d’inhibiteurs d’entrée et d’AN dans le VHB chronique a considérablement réduit la charge virale par rapport à ceux ciblant uniquement la réplication virale ^5,6. Cependant, le modèle classique d’hépatocytes pour le dépistage des inhibiteurs de l’entrée du VHB est limité par de faibles niveaux de récepteurs viraux (polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium, NTCP). La surexpression du PCNh dans les cellules d’hépatome (c.-à-d. HepG2 et Huh7) améliore l’infectiosité^du VHB ^7,8. Néanmoins, ces lignées cellulaires expriment de faibles niveaux d’enzymes métabolisant les médicaments de phase I et II et présentent une instabilité génétique⁹. Les modèles hépatocytes qui peuvent aider à cibler des mécanismes distincts des composés anti-VHB candidats tels que l’entrée prévirale, la liaison au PNCP et l’entrée virale accéléreraient l’identification et le développement de schémas thérapeutiques combinés efficaces. L’étude sur l’activité anti-VHB de la curcumine a élucidé l’inhibition de l’entrée virale en tant que nouveau mécanisme en plus de l’interruption post-entrée virale. Ce protocole détaille un modèle hôte pour le criblage des molécules d’entrée anti-VHB¹⁰.

L’objectif de cette méthode est d’explorer des composés anti-VHB candidats pour l’inhibition de l’entrée virale, en particulier le blocage de la liaison et du transport du NTCP. Comme l’expression du PNCP est un facteur critique pour l’entrée et l’infection du VHB, nous avons optimisé le protocole de maturation des hépatocytes pour maximiser les niveaux de NTCP¹¹. En outre, ce protocole peut différencier l’effet inhibiteur sur l’entrée du VHB comme inhibition de l’attachement du VHB par rapport à l’inhibition de l’internalisation. Le test d’absorption de l’acide taurocholique (TCA) a également été modifié à l’aide d’une méthode basée sur ELISA au lieu d’un radio-isotope pour représenter le transport du PNCC^12,13. L’interaction récepteur et ligand a été confirmée par leurs structures 3D^14,15. L’inhibition de la fonction du PNCC peut être évaluée en mesurant l’activité d’absorption du TCA¹⁶. Cependant, cette technique n’a pas fourni de preuve directe de la liaison du PNCC aux inhibiteurs candidats. Par conséquent, la liaison peut être étudiée à l’aide de diverses techniques, telles que la résonance plasmonique^{de surface 17}, ELISA, le test de décalage thermique basé sur la fluorescence (FTSA)18, FRET ¹⁹, AlphaScreen et diverses autres méthodes²⁰. Parmi ces techniques, l’ITC est un standard d’objectif dans l’analyse de liaison car il permet d’observer l’absorption ou l’émission de chaleur dans presque toutes les réactions²¹. L’affinité de liaison (K_D) du PNCC et des composés candidats a été directement évaluée à l’aide de l’ITC; Ces valeurs d’affinité étaient plus précises que celles obtenues à l’aide du modèle de prédiction in silico ²².

Ce protocole couvre les techniques de maturation des hépatocytes, d’infection par le VHB et de dépistage des inhibiteurs d’entrée du VHB. En bref, un modèle d’hépatocytes a été développé à partir de lignées cellulaires imHC et HepaRG. Les cellules en culture ont été différenciées en hépatocytes matures en 2 semaines. La régulation positive des niveaux de NTCP a été détectée à l’aide de la PCR en temps réel, du transfert Western et de la cytométrie^{en flux 11}. Le virion de l’hépatite B (VHB) a été produit et recueilli à partir de l’hépatite HepG2.2.15. L’icHC différencié ou HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) a été traité de manière prophylactique avec les candidats anti-VHB 2 h avant l’inoculation avec le virion du VHB. Le résultat attendu de l’expérience était l’identification des agents qui diminuent le VHB cellulaire et l’infectiosité. L’activité anti-PNCC a été évaluée à l’aide du test d’absorption du TCA. L’activité du PNCP pouvait être supprimée par les agents qui liaient spécifiquement le PNCP. La technique ITC a été utilisée pour étudier la faisabilité d’une liaison interactive qui pourrait prédire les inhibiteurs et leurs protéines cibles, en déterminant l’affinité de liaison (K_D) du ligand pour le récepteur via des interactions non covalentes du complexe biomoléculaire^23,24. Par exemple, K D ≥ 1 × 10³ mM représente une liaison faible, K D ≥ 1 × 10⁶ μM représente une liaison modérée et K _D ≤ 1 × 10⁹ nM représente une liaison forte. Le ΔG est directement corrélé avec les interactions de liaison. En particulier, une réaction avec ΔG négatif est une réaction exergonique, indiquant que la liaison est un processus spontané. Une réaction avec un ΔH négatif indique que les processus de liaison dépendent de la liaison hydrogène et des forces de Van der Waals. L’absorption du TCA et les données de l’ITC pourraient être utilisées pour dépister les agents anti-VHB. Les résultats de ces protocoles peuvent fournir une base non seulement pour le dépistage anti-VHB, mais aussi pour l’interaction avec le PNCP telle qu’évaluée par affinité de liaison et fonction de transport. Cet article décrit la préparation et la caractérisation des cellules hôtes, la conception expérimentale et l’évaluation de l’entrée anti-VHB ainsi que l’affinité de liaison NTCP.

Protocol

NOTA: Les procédures suivantes doivent être effectuées dans une hotte à écoulement à risque biologique de classe II ou une hotte à écoulement laminaire. La manipulation du VHB a été approuvée sur le plan éthique par la CISR (MURA2020/1545). Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur toutes les solutions, réactifs, équipements et lignées cellulaires utilisés dans ce protocole. 1. Préparation des cellules hôtes (hépatocytes matures)</s…

Representative Results

Des caractéristiques de maturation hépatique ont été observées, y compris des cellules binucléées et une morphologie de forme polygonale (Figure 1), en particulier au stade différencié de l’HCi (Figure 1A). Une forte augmentation de l’expression du PNNT a été mesurée dans le d-HepaRG et le d-imHC à 7 fois et 40 fois, respectivement (Figure 1B). La forme hautement glycosylée du PNCP, supposée conférer une suscepti…

Discussion

L’infection par le VHB est initiée par une liaison de faible affinité aux protéoglycanes sulfate d’héparane (HSPG) sur les hépatocytes²⁵, suivie de la liaison au PNCP avec internalisation ultérieure par endocytose²⁶. Comme le PNCP est un récepteur crucial pour l’entrée du VHB, cibler l’entrée du VHB peut être cliniquement traduit pour diminuer l’infection de novo , la transmission mère-enfant (TME) et la récidive après une transplantation hé…

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved	Thermo Fisher Scientific	HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line	Merck	SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution	FUJIFLIM Wako chemical	163-20145
BD Perm/Wash buffer	BD Biosciences	554723	Perm/Wash buffer
Cyclosporin A	abcam	59865-13-3
EDTA	Invitrogen	15575-038	8 mM
G 418 disulfate salt	Merck	108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x)	Thermo Scientific	78425
HEPES	Merck	7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits	GE Healthcare	25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit	GE Healthcare	25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System	Promega	A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit	Kapa Biosystems	KK4600
Lenti-X Concentrator	Takara bio	PT4421-2	concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate	Merck	WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal	Kapa Biosystems	KK4600
Nucleospin DNA extraction kit	macherey-nagel	1806/003
Phosphate buffered saline	Merck	P3813
Polyethylene glycol 8000	Merck	25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo scientific	P36930
Recombinant NTCP	Cloud-Clone	RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)	Merck	20-188
TCA	Sigma	345909-26-4
TCA Elisa kit	Mybiosource	MB2033685
Triton X-100	Merck	9036-19-5
Trypsin-EDTA	Gibco	25200072	Dilute to 0.125%
Antibodies
Anti-NTCP1 antibody	Abcam	ab131084	1:100 dilution
Anti-GAPDH antibody	Thermo Fisher Scientific	AM4300	1:200,000 dilution
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	Abcam	ab205718	1:10,000 dilution
HRP goat anti-mouse secondary antibody	Abcam	ab97023	1:10,000 dilution
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008	1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
1x TBST
3% BSA	Sigma	A7906-100G	Working concentration: 3%
Sodium azide	Sigma	199931	Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
DME/F12	Gibco	12400-024
10% FBS	Sigma Aldrich	F7524
1% Pen/Strep	HyClon	SV30010
1% GlutaMAX	Gibco	35050-061
Hepatic maturation medium
Williams’ E medium	Sigma Aldrich	W4125-1L
10% FBS	Sigma Aldrich	F7524
1% Pen/Strep	HyClon	SV30010
1% GlutaMAX	Gibco	35050-061
5 µg/mL  Insulin	Sigma Aldrich	91077C-100MG
50 µM hydrocotisone	Sigma Aldrich	H0888-1g
2% DMSO	PanReac AppliChem	A3672-250ml
IF Blocking solution
1x PBS	Gibco	21300-058
3% BSA	Sigma	A7906-100G	Working concentration: 3%
0.2% Triton X-100	Sigma	T8787	Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution	Merck	20-188	Final concentration: 1X
Protease Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78425	Final concentration: 1X
Na3VO4			Final concentration: 1 mM
PMSF			Final concentration: 1 mM
NaF			Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Tween 20	Merck	9005-64-5
1x TBST			0.1% Tween 20
1x PBS	Gibco	21300-058
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	A53225
Polyacrylamide gel	Bio-Rad	161-0183
Ammonium Persulfate (APS)	Bio-Rad	161-0700	Final concentration: 0.05%
TEMED	Bio-Rad	161-0800	Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	161-0737	Final concentration: 1X
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
1x TBST
5% Skim milk (nonfat dry milk)	Bio-Rad	170-6404	Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Glycine	Sigma	G8898	14.4 g
SDS	Merck	7910	Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
10x Tris-buffered saline (TBS)	Bio-Rad	170-6435	Final concentration: 1X
Glycine	Sigma	G8898	7.2 g
Methanol	Merck	106009	100 mL
Mild stripping solution 1 L			Adjust pH to 2.2
Glycine	Sigma	G8898	15 g
SDS	Merck	7910	1 g
Tween 20	Merck	9005-64-5	10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube	Corning	430052
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
Airstream Class II	Esco	2010621	Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator	Esco	2170002	Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector	Bio-Rad	1855196
FACSVerse Flow Cytometer	BD Biosciences	651154
Graduated pipettes (10 mL)	Jet Biofil	GSP010010
Graduated pipettes (5 mL)	Jet Biofil	GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC	Malvern		Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658004	Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper	Bio-Rad	1703932
Omega Lum G Imaging System	Aplegen	8418-10-0005
Pipette controller	Eppendorf	4430000.018	Easypet 3
PowerPac HC	Bio-Rad	1645052	Power supply
PVDF membrane	Merck	IPVH00010
T-75 A91:D106flask	Corning	431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	1703940	Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)	Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge	Esco	T1000R	Centrifuge with swinging bucket rotar