एक सक्षम हेपेटोसाइट मॉडल एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में सोडियम टौरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड के माध्यम से हेपेटाइटिस बी वायरस प्रवेश की जांच करता है
Summary
हम मेजबान सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड के साथ बाध्यकारी आत्मीयता (केडी) को मापने के लिए आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री का उपयोग करके, पूर्व और बाद के वायरल प्रवेश जीवनचक्र चरणों को लक्षित करने वाले एंटी-हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एंटीवायरल प्रभावकारिता वायरल जीवनचक्र मार्करों (सीसीसीडीएनए गठन, प्रतिलेखन और वायरल असेंबली) के दमन के माध्यम से निर्धारित की गई थी।
Abstract
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण को हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक माना जाता है। वर्तमान उपचार केवल वायरल लोड को कम कर सकता है लेकिन इसके परिणामस्वरूप पूर्ण छूट नहीं हो सकती है। एचबीवी संक्रमण के लिए एक कुशल हेपेटोसाइट मॉडल एक सच्चे-से-जीवन वायरल जीवन चक्र की पेशकश करेगा जो चिकित्सीय एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण होगा। अधिकांश उपलब्ध एंटी-एचबीवी एजेंट वायरल प्रविष्टि के बाद जीवनचक्र चरणों को लक्षित करते हैं लेकिन वायरल प्रविष्टि से पहले नहीं। यह प्रोटोकॉल एक सक्षम हेपेटोसाइट मॉडल की पीढ़ी का विवरण देता है जो पूर्व-वायरल प्रविष्टि और पोस्ट वायरल प्रवेश जीवनचक्र चरणों को लक्षित करने वाले चिकित्सीय एजेंटों के लिए स्क्रीनिंग करने में सक्षम है। इसमें मेजबान कोशिकाओं के रूप में आईएमएचसी या हेपएआरजी के आधार पर सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड (एनटीसीपी) बाइंडिंग, सीसीसीडीएनए गठन, प्रतिलेखन और वायरल असेंबली का लक्ष्यीकरण शामिल है। यहां, एचबीवी प्रवेश निषेध परख ने एचबीवी बाइंडिंग को रोकने और एनटीसीपी के माध्यम से कार्यों को परिवहन करने के लिए कर्क्यूमिन का उपयोग किया। इनहिबिटर्स का मूल्यांकन इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) का उपयोग करके एनटीसीपी के साथ बाध्यकारी आत्मीयता (केडी) के लिए किया गया था – थर्मोडायनामिक मापदंडों के आधार पर एचबीवी दवा स्क्रीनिंग के लिए एक सार्वभौमिक उपकरण।
Introduction
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण को दुनिया भर में एक जानलेवा बीमारी माना जाता है। क्रोनिक एचबीवी संक्रमण यकृत सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा1 के जोखिम से भरा हुआ है। वर्तमान एंटी-एचबीवी उपचार ज्यादातर न्यूक्लियोस (टी) आईडी एनालॉग्स (एनए) और इंटरफेरॉन-अल्फा (आईएफएन-α) 2,3 का उपयोग करके पोस्ट वायरल एंट्री पर केंद्रित है। एक एचबीवी प्रवेश अवरोधक, मिरक्ल्यूडेक्स बी की खोज ने एंटी-एचबीवीएजेंटों 4 के लिए एक नए लक्ष्य की पहचान की है। क्रोनिक एचबीवी में एंट्री इनहिबिटर और एनए के संयोजनने अकेले वायरल प्रतिकृति को लक्षित करने वालों की तुलना में वायरल लोड को काफी कम कर दिया है। हालांकि, एचबीवी एंट्री इनहिबिटर की स्क्रीनिंग के लिए शास्त्रीय हेपेटोसाइट मॉडल कम वायरल रिसेप्टर स्तरों (सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड, एनटीसीपी) द्वारा सीमित है। हेपेटोमा कोशिकाओं (यानी, हेपजी 2 और हुह 7) में एचएनटीसीपी की अतिवृद्धि एचबीवी संक्रामकता 7,8 में सुधार करती है। फिर भी, ये सेल लाइनें चरण I और II दवा-चयापचय एंजाइमों के निम्न स्तर को व्यक्त करती हैं और आनुवंशिक अस्थिरता प्रदर्शित करतीहैं। हेपेटोसाइट मॉडल जो उम्मीदवार एंटी-एचबीवी यौगिकों जैसे प्रीवायरल एंट्री, एनटीसीपी बाइंडिंग और वायरल एंट्री के अलग-अलग तंत्र को लक्षित करने में मदद कर सकते हैं, प्रभावोत्पादक संयोजन आहार की पहचान और विकास में तेजी लाएंगे। कर्क्यूमिन की एंटी-एचबीवी गतिविधि के अध्ययन ने पोस्ट वायरल एंट्री रुकावट के अलावा एक नए तंत्र के रूप में वायरल एंट्री के निषेध को स्पष्ट किया है। यह प्रोटोकॉल एंटी-एचबीवी प्रवेश अणुओं 10 की स्क्रीनिंग के लिए एक मेजबान मॉडल का विवरणदेता है।
इस विधि का लक्ष्य वायरल प्रवेश निषेध के लिए उम्मीदवार एंटी-एचबीवी यौगिकों का पता लगाना है, विशेष रूप से एनटीसीपी बाइंडिंग और परिवहन को अवरुद्ध करना। चूंकि एनटीसीपी अभिव्यक्ति एचबीवी प्रवेश और संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, इसलिए हमने एनटीसीपी स्तर11 को अधिकतम करने के लिए हेपेटोसाइट परिपक्वता प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एचबीवी प्रवेश पर निरोधात्मक प्रभाव को एचबीवी अनुलग्नक के निषेध बनाम आंतरिककरण के निषेध के रूप में अलग कर सकता है। टॉरोकोलिक एसिड (टीसीए) अपटेक परख को एनटीसीपी परिवहन12,13 का प्रतिनिधित्व करने के लिए रेडियोआइसोटोप के बजाय एलिसा-आधारित विधि का उपयोग करके भी संशोधित किया गया था। रिसेप्टर और लिगैंड इंटरैक्शन की पुष्टि उनके 3 डी संरचनाओं14,15 द्वारा की गई थी। एनटीसीपी फ़ंक्शन के निषेध का मूल्यांकन टीसीए अपटेक गतिविधि16 को मापकर किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक ने उम्मीदवार अवरोधकों के लिए एनटीसीपी बाइंडिंग का प्रत्यक्ष प्रमाण प्रदान नहीं किया। इसलिए, बाइंडिंग की जांच विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके की जा सकती है, जैसे कि सतह प्लास्मोन अनुनाद17, एलिसा, फ्लोरेसेंस-आधारित थर्मल शिफ्ट परख (एफटीएसए)18, फ्रेट19, अल्फास्क्रीन, और विभिन्न अन्य तरीके20। इन तकनीकों के बीच, आईटीसी बाध्यकारी विश्लेषण में एक लक्ष्य मानक है क्योंकि यह लगभग हर प्रतिक्रिया 21 में गर्मी अवशोषण या उत्सर्जन का निरीक्षण करसकता है। एनटीसीपी और उम्मीदवार यौगिकों के बाध्यकारी आत्मीयता (केडी) का आईटीसी का उपयोग करके सीधे मूल्यांकन किया गया था; ये आत्मीयता मान सिलिको भविष्यवाणी मॉडल22 का उपयोग करके प्राप्त किए गए लोगों की तुलना में अधिक सटीक थे।
यह प्रोटोकॉल हेपेटोसाइट परिपक्वता, एचबीवी संक्रमण और एचबीवी प्रवेश अवरोधक के लिए स्क्रीनिंग में तकनीकों को शामिल करता है। संक्षेप में, आईएमएचसी और हेपरग सेल लाइनों के आधार पर एक हेपेटोसाइट मॉडल विकसित किया गया था। सुसंस्कृत कोशिकाओं को 2 सप्ताह के भीतर परिपक्व हेपेटोसाइट्स में विभेदित किया गया था। वास्तविक समय पीसीआर, पश्चिमी धब्बा और प्रवाह साइटोमेट्री11 का उपयोग करके एनटीसीपी स्तरों के अपरेग्यूलेशन का पता लगाया गया था। हेपेटाइटिस बी वायरियन (एचबीवीसीसी) का उत्पादन और हेपजी 2.2.15 से एकत्र किया गया था। विभेदित आईएमएचसी या हेपएआरजी (डी-आईएमएचसी, डी-हेपएआरजी) को एचबीवी विषाणु के साथ टीकाकरण से 2 घंटे पहले एंटी-एचबीवी उम्मीदवारों के साथ रोगनिरोधी रूप से इलाज किया गया था। प्रयोग का अपेक्षित परिणाम उन एजेंटों की पहचान थी जो सेलुलर एचबीवी और संक्रामकता को कम करते हैं। टीसीए अपटेक परख का उपयोग करके एंटी-एनटीसीपी गतिविधि का मूल्यांकन किया गया था। एनटीसीपी गतिविधि को उन एजेंटों द्वारा दबाया जा सकता है जो विशेष रूप से एनटीसीपी को बाध्य करते हैं। आईटीसी तकनीक को इंटरैक्टिव बाइंडिंग की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए नियोजित किया गया था जो इनहिबिटर और उनके लक्ष्य प्रोटीन की भविष्यवाणी कर सकता है, बायोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स23,24 के गैर-सहसंयोजक इंटरैक्शन के माध्यम से रिसेप्टर के लिए लिगैंड के बाध्यकारी आत्मीयता (केडी) का निर्धारण कर सकता है। उदाहरण के लिए, KD ≥ 1 × 103 mM कमजोर बाइंडिंग का प्रतिनिधित्व करता है, KD ≥ 1 × 106 μM मध्यम बाइंडिंग का प्रतिनिधित्व करता है, और KD ≤ 1 × 109 nM मजबूत बाइंडिंग का प्रतिनिधित्व करता है। ऍजी सीधे बाध्यकारी इंटरैक्शन के साथ सहसंबद्ध है। विशेष रूप से, नकारात्मक एजी के साथ एक प्रतिक्रिया एक एक्सर्जोनिक प्रतिक्रिया है, यह दर्शाता है कि बंधन एक सहज प्रक्रिया है। एक नकारात्मक ओएच के साथ एक प्रतिक्रिया इंगित करती है कि बाध्यकारी प्रक्रियाएं हाइड्रोजन बॉन्डिंग और वैन डेर वाल्स बलों पर निर्भर करती हैं। टीसीए अपटेक और आईटीसी डेटा दोनों का उपयोग एंटी-एचबीवी एंट्री एजेंटों के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इन प्रोटोकॉल के परिणाम न केवल एंटी-एचबीवी स्क्रीनिंग के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं, बल्कि बाध्यकारी आत्मीयता और परिवहन समारोह के माध्यम से मूल्यांकन के रूप में एनटीसीपी के साथ बातचीत भी कर सकते हैं। यह पेपर मेजबान सेल तैयारी और लक्षण वर्णन, प्रयोगात्मक डिजाइन और एनटीसीपी बाध्यकारी आत्मीयता के साथ एंटी-एचबीवी प्रविष्टि के मूल्यांकन का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचबीवी संक्रमण हेपेटोसाइट्स25 पर हेपरन सल्फेट प्रोटीओग्लाइकेन्स (एचएसपीजी) के लिए कम-आत्मीयता बंधन के माध्यम से शुरू होता है, इसके बाद एंडोसाइटोसिस26 के माध्यम से बाद में आंतरिककरण क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध परियोजना को माहिडोल विश्वविद्यालय और थाईलैंड विज्ञान अनुसंधान और नवाचार (टीएसआरआई) द्वारा अलग से ए वोंगकाजोर्नसिल्प और के सा-एनगियाम्सुंटॉर्न को दिया गया है। इस काम को राष्ट्रीय उच्च शिक्षा विज्ञान अनुसंधान और नवाचार नीति परिषद के कार्यालय द्वारा प्रतिस्पर्धा के लिए कार्यक्रम प्रबंधन इकाई (अनुदान संख्या C10F630093) के माध्यम से वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। वोंगकाजोर्नसिल्प चिकित्सा संकाय सिरिराज अस्पताल, माहिडोल विश्वविद्यालय के चेलेरम्प्राकिट अनुदान के प्राप्तकर्ता हैं। लेखक आईटीसी तकनीक के साथ उनकी सहायता के लिए मिस सविनी सीमाखान (ड्रग डिस्कवरी के लिए उत्कृष्ट केंद्र, विज्ञान संकाय, महिडोल विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
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