Un modello di epatociti competente che esamina l'ingresso del virus dell'epatite B attraverso il taurococolato di sodio che trasporta il polipeptide come bersaglio terapeutico
Summary
Presentiamo un protocollo per lo screening dei composti del virus anti-epatite B (HBV) mirati alle fasi del ciclo di vita di ingresso pre e post-virale, utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione per misurare l’affinità di legame (KD) con il polipeptide cotrasportante del taurocolato di sodio ospite. L’efficacia antivirale è stata determinata attraverso la soppressione dei marcatori del ciclo di vita virale (formazione del cccDNA, trascrizione e assemblaggio virale).
Abstract
L’infezione da virus dell’epatite B (HBV) è stata considerata un fattore di rischio cruciale per il carcinoma epatocellulare. Il trattamento attuale può solo ridurre la carica virale ma non provocare una remissione completa. Un modello epatocitario efficiente per l’infezione da HBV offrirebbe un ciclo di vita virale realistico che sarebbe cruciale per lo screening degli agenti terapeutici. La maggior parte degli agenti anti-HBV disponibili si rivolge alle fasi del ciclo di vita dopo l’ingresso virale, ma non prima dell’ingresso virale. Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di un modello di epatociti competente in grado di selezionare gli agenti terapeutici mirati alle fasi del ciclo di vita dell’ingresso pre-virale e post-virale. Ciò include il targeting del legame del polipeptide cotrasportatore di taurocolato di sodio (NTCP), la formazione del cccDNA, la trascrizione e l’assemblaggio virale basato su imHC o HepaRG come cellule ospiti. Qui, il test di inibizione dell’ingresso HBV ha utilizzato la curcumina per inibire il legame e le funzioni di trasporto dell’HBV tramite NTCP. Gli inibitori sono stati valutati per l’affinità di legame (KD) con NTCP utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), uno strumento universale per lo screening dei farmaci HBV basato su parametri termodinamici.
Introduction
L’infezione da virus dell’epatite B (HBV) è considerata una malattia pericolosa per la vita in tutto il mondo. L’infezione cronica da HBV è carica di un rischio di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare1. L’attuale trattamento anti-HBV si concentra principalmente sull’ingresso post-virale utilizzando analoghi nucleos(t)ide (NAs) e interferone-alfa (IFN-α)2,3. La scoperta di un inibitore dell’ingresso dell’HBV, Myrcludex B, ha identificato un nuovo bersaglio per gli agenti anti-HBV4. La combinazione di inibitori di ingresso e NA nell’HBV cronico ha ridotto significativamente la carica virale rispetto a quelli mirati alla sola replicazione virale 5,6. Tuttavia, il modello classico di epatociti per lo screening degli inibitori dell’ingresso dell’HBV è limitato da bassi livelli di recettori virali (polipeptide di cotrasporto del taurocolato di sodio, NTCP). La sovraespressione di hNTCP nelle cellule di epatoma (cioè HepG2 e Huh7) migliora l’infettività dell’HBV 7,8. Tuttavia, queste linee cellulari esprimono bassi livelli di enzimi che metabolizzano i farmaci di fase I e II e mostrano instabilità genetica9. I modelli di epatociti che possono aiutare a colpire meccanismi distinti di composti anti-HBV candidati come l’ingresso previrale, il legame NTCP e l’ingresso virale accelererebbero l’identificazione e lo sviluppo di regimi di combinazione efficaci. Lo studio per l’attività anti-HBV della curcumina ha chiarito l’inibizione dell’ingresso virale come un nuovo meccanismo oltre all’interruzione post-ingresso virale. Questo protocollo descrive un modello ospite per lo screening delle molecole di ingresso anti-HBV10.
L’obiettivo di questo metodo è quello di esplorare i composti anti-HBV candidati per l’inibizione dell’ingresso virale, in particolare bloccando il legame e il trasporto NTCP. Poiché l’espressione di NTCP è un fattore critico per l’ingresso e l’infezione da HBV, abbiamo ottimizzato il protocollo di maturazione degli epatociti per massimizzare i livelli di NTCP11. Inoltre, questo protocollo può differenziare l’effetto inibitorio sull’ingresso dell’HBV come inibizione dell’attaccamento dell’HBV rispetto all’inibizione dell’internalizzazione. Anche il test di assorbimento dell’acido taurocolico (TCA) è stato modificato utilizzando un metodo basato su ELISA anziché un radioisotopo per rappresentare il trasporto NTCP12,13. L’interazione tra recettore e ligando è stata confermata dalle loro strutture 3D14,15. L’inibizione della funzione NTCP può essere valutata misurando l’attività di captazione del TCA16. Tuttavia, questa tecnica non ha fornito prove dirette del legame NTCP ai candidati inibitori. Pertanto, il legame può essere studiato utilizzando varie tecniche, come la risonanza plasmonica di superficie 17, ELISA, saggio di spostamento termico basato sulla fluorescenza (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen e vari altri metodi20. Tra queste tecniche, l’ITC è uno standard obiettivo nell’analisi di legame perché può osservare l’assorbimento o l’emissione di calore in quasi tutte le reazioni21. L’affinità di legame (KD) di NTCP e composti candidati è stata valutata direttamente utilizzando ITC; Questi valori di affinità erano più precisi di quelli ottenuti utilizzando il modello di previsione in silico 22.
Questo protocollo copre le tecniche di maturazione degli epatociti, l’infezione da HBV e lo screening per l’inibitore dell’ingresso dell’HBV. In breve, è stato sviluppato un modello di epatociti basato su linee cellulari imHC e HepaRG. Le cellule coltivate sono state differenziate in epatociti maturi entro 2 settimane. La sovraregolazione dei livelli di NTCP è stata rilevata utilizzando la PCR in tempo reale, il western blot e la citometria a flusso11. Il virione dell’epatite B (HBVcc) è stato prodotto e raccolto da HepG2.2.15. L’imHC differenziato o HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) è stato trattato profilatticamente con i candidati anti-HBV 2 ore prima dell’inoculazione con il virione HBV. Il risultato atteso dell’esperimento era l’identificazione degli agenti che riducono l’HBV cellulare e l’infettività. L’attività anti-NTCP è stata valutata utilizzando il test di assorbimento TCA. L’attività NTCP potrebbe essere soppressa dagli agenti che hanno associato specificamente NTCP. La tecnica ITC è stata impiegata per studiare la fattibilità di un legame interattivo che potrebbe prevedere gli inibitori e le loro proteine bersaglio, determinando l’affinità di legame (KD) del ligando per il recettore attraverso interazioni non covalenti del complesso biomolecolare23,24. Ad esempio, K D ≥ 1 × 103 mM rappresenta il legame debole, K D ≥ 1 × 106 μM rappresenta un legame moderato e K D ≤ 1 × 109 nM rappresenta un legame forte. Il ΔG è direttamente correlato con le interazioni di legame. In particolare, una reazione con ΔG negativo è una reazione esoergonica, che indica che il legame è un processo spontaneo. Una reazione con un ΔH negativo indica che i processi di legame dipendono dal legame idrogeno e dalle forze di Van der Waals. Sia l’assorbimento del TCA che i dati ITC potrebbero essere utilizzati per lo screening degli agenti di ingresso anti-HBV. I risultati di questi protocolli possono fornire una base non solo per lo screening anti-HBV, ma anche per l’interazione con NTCP valutata attraverso l’affinità di legame e la funzione di trasporto. Questo articolo descrive la preparazione e la caratterizzazione della cellula ospite, il disegno sperimentale e la valutazione dell’ingresso anti-HBV insieme all’affinità di legame NTCP.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’infezione da HBV viene avviata attraverso il legame a bassa affinità ai proteoglicani dell’eparan solfato (HSPG) sugli epatociti25, seguito dal legame a NTCP con successiva internalizzazione attraverso l’endocitosi26. Poiché NTCP è un recettore cruciale per l’ingresso dell’HBV, l’ingresso mirato all’HBV può essere clinicamente tradotto per ridurre l’infezione de novo , la trasmissione madre-figlio (MTCT) e la recidiva dopo trapianto di fegato. Interrompere l’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto di ricerca è supportato dalla Mahidol University e dalla Thailand Science Research and Innovation (TSRI) assegnati separatamente ad A. Wongkajornsilp e K. Sa-ngiamsuntorn. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall’Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council attraverso il Program Management Unit for Competitiveness (numero di sovvenzione C10F630093). A. Wongkajornsilp ha ricevuto una borsa di studio Chalermprakiat della Facoltà di Medicina Siriraj Hospital, Mahidol University. Gli autori desiderano ringraziare Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) per la sua assistenza con la tecnica ITC.
Materials
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
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