En kompetent hepatocyttmodell som undersøker hepatitt B-virusinngang gjennom natriumtaurokolat som transporterer polypeptid som terapeutisk mål
Summary
Vi presenterer en protokoll for å screene anti-hepatitt B-virus (HBV) forbindelser rettet mot pre- og post-viral oppføring livssyklus stadier, ved hjelp av isotermisk titrering kalorimetri for å måle binding affinitet (KD) med vert natrium taurocholate cotransporting polypeptid. Antiviral effekt ble bestemt gjennom undertrykkelse av virale livssyklusmarkører (cccDNA-dannelse, transkripsjon og viral montering).
Abstract
Hepatitt B-virus (HBV) infeksjon har blitt ansett som en avgjørende risikofaktor for hepatocellulært karsinom. Nåværende behandling kan bare redusere virusbelastningen, men ikke resultere i fullstendig remisjon. En effektiv hepatocyttmodell for HBV-infeksjon vil tilby en sann viral livssyklus som vil være avgjørende for screening av terapeutiske midler. De fleste tilgjengelige anti-HBV-midler er rettet mot livssyklusstadier etter viral oppføring, men ikke før viral oppføring. Denne protokollen beskriver genereringen av en kompetent hepatocyttmodell som er i stand til å screene for terapeutiske midler rettet mot pre-viral oppføring og livssyklusstadier etter virusinngang. Dette inkluderer målretting av natriumtaurokolat som transporterer polypeptid (NTCP), cccDNA-dannelse, transkripsjon og viral montering basert på imHC eller HepaRG som vertsceller. Her brukte HBV-inngangshemmingsanalysen curcumin for å hemme HBV-bindings- og transportfunksjoner via NTCP. Hemmerne ble evaluert for bindingsaffinitet (KD) med NTCP ved bruk av isotermisk titreringskalorimetri (ITC)-et universelt verktøy for HBV-legemiddelscreening basert på termodynamiske parametere.
Introduction
Hepatitt B-virus (HBV) infeksjon regnes som en livstruende sykdom over hele verden. Kronisk HBV-infeksjon er belastet med risiko for levercirrhose og hepatocellulært karsinom1. Nåværende anti-HBV-behandling fokuserer hovedsakelig på postviral oppføring ved bruk av nukleos (t) idanaloger (NAs) og interferon-alfa (IFN-α) 2,3. Oppdagelsen av en HBV-inngangshemmer, Myrcludex B, har identifisert et nytt mål for anti-HBV-midler4. Kombinasjonen av inngangshemmere og NAer i kronisk HBV har betydelig redusert virusbelastningen sammenlignet med de som retter seg mot viral replikasjon alene 5,6. Den klassiske hepatocyttmodellen for screening av HBV-inngangshemmere er imidlertid begrenset av lave virale reseptornivåer (natriumtaurokolat som transporterer polypeptid, NTCP). Overekspresjonen av hNTCP i hepatomceller (dvs. HepG2 og Huh7) forbedrer HBV-smittsomhet 7,8. Likevel uttrykker disse cellelinjene lave nivåer av fase I og II legemiddelmetaboliserende enzymer og utviser genetisk ustabilitet9. Hepatocyttmodeller som kan bidra til å målrette forskjellige mekanismer for kandidat-anti-HBV-forbindelser som previral oppføring, NTCP-binding og viral oppføring, vil fremskynde identifisering og utvikling av effektive kombinasjonsregimer. Studien for anti-HBV-aktivitet av curcumin har belyst inhiberingen av viral oppføring som en ny mekanisme i tillegg til postviral inngangsavbrudd. Denne protokollen beskriver en vertsmodell for screening av anti-HBV-inngangsmolekyler10.
Målet med denne metoden er å utforske kandidat anti-HBV forbindelser for viral oppføring hemming, spesielt blokkerer NTCP binding og transport. Siden NTCP-uttrykk er en kritisk faktor for HBV-oppføring og infeksjon, optimaliserte vi hepatocyttmodningsprotokollen for å maksimere NTCP-nivåene11. I tillegg kan denne protokollen differensiere den hemmende effekten på HBV-oppføring som inhibering av HBV-vedlegg versus inhibering av internalisering. Taurokolsyreanalysen (TCA) ble også modifisert ved hjelp av en ELISA-basert metode i stedet for en radioisotop for å representere NTCP-transport12,13. Reseptor- og ligandinteraksjonen ble bekreftet av deres 3D-strukturer14,15. Hemmingen av NTCP-funksjonen kan evalueres ved å måle TCA-opptaksaktivitet16. Denne teknikken ga imidlertid ikke direkte bevis for NTCP-binding til kandidathemmerne. Derfor kan bindingen undersøkes ved hjelp av forskjellige teknikker, for eksempel overflateplasmonresonans 17, ELISA, fluorescensbasert termisk skiftanalyse (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen og forskjellige andre metoder20. Blant disse teknikkene er ITC en målstandard i bindingsanalyse fordi den kan observere varmeabsorpsjon eller utslipp i nesten hver reaksjon21. Bindingsaffiniteten (KD) til NTCP og kandidatforbindelser ble direkte evaluert ved hjelp av ITC; Disse affinitetsverdiene var mer presise enn de som ble oppnådd ved bruk av In Silico prediksjonsmodell22.
Denne protokollen dekker teknikker i hepatocyttmodning, HBV-infeksjon og screening for HBV-inngangshemmer. Kort fortalt ble det utviklet en hepatocyttmodell basert på imHC- og HepaRG-cellelinjer. De dyrkede cellene ble differensiert til modne hepatocytter innen 2 uker. Oppregulering av NTCP-nivåer ble påvist ved bruk av sanntids PCR, western blot og flowcytometri11. Hepatitt B-virion (HBVcc) ble produsert og samlet inn fra HepG2.2.15. Den differensierte imHC eller HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) ble profylaktisk behandlet med anti-HBV-kandidatene 2 timer før inokuleringen med HBV-virion. Det forventede resultatet av forsøket var identifisering av midlene som reduserer cellulær HBV og smittsomhet. Anti-NTCP-aktivitet ble evaluert ved hjelp av TCA-opptaksanalysen. NTCP-aktivitet kan undertrykkes av agenter som spesifikt bundet NTCP. ITC-teknikken ble brukt til å undersøke muligheten for interaktiv binding som kunne forutsi inhibitorer og deres målproteiner, og bestemme bindingsaffiniteten (KD) av liganden for reseptoren via ikke-kovalente interaksjoner av det biomolekylære komplekset23,24. For eksempel representerer K D ≥ 1 × 103 mM svak binding, K D ≥ 1 × 106 μM representerer moderat binding, og K D ≤ 1 × 109 nM representerer sterk binding. ΔG er direkte korrelert med bindingsinteraksjoner. Spesielt er en reaksjon med negativ ΔG en eksergonisk reaksjon, noe som indikerer at binding er en spontan prosess. En reaksjon med negativ ΔH indikerer at bindingsprosessene er avhengige av hydrogenbinding og Van der Waals-krefter. Både TCA-opptak og ITC-data kan brukes til å screene for anti-HBV-inngangsagenter. Resultatene av disse protokollene kan gi grunnlag for ikke bare anti-HBV-screening, men også interaksjonen med NTCP vurdert gjennom bindingsaffinitet og transportfunksjon. Denne artikkelen beskriver vertscellepreparering og karakterisering, eksperimentell design og evaluering av anti-HBV-oppføringen sammen med NTCP-bindingsaffiniteten.
Protocol
Representative Results
Discussion
HBV-infeksjon initieres via lavaffinitetsbinding til heparansulfatproteoglykaner (HSPG) på hepatocytter25, etterfulgt av binding til NTCP med påfølgende internalisering gjennom endocytose26. Siden NTCP er en avgjørende reseptor for HBV-oppføring, kan målretting av HBV-oppføring klinisk oversettes for å redusere de novo-infeksjon , mor-til-barn-overføring (MTCT) og tilbakefall etter levertransplantasjon. Avbryte viral oppføring ville være et mulig alterna…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette forskningsprosjektet er støttet av Mahidol University og Thailand Science Research and Innovation (TSRI) separat tildelt A. Wongkajornsilp og K. Sa-ngiamsuntorn. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council gjennom Program Management Unit for Competitiveness (tilskuddsnummer C10F630093). A. Wongkajornsilp er mottaker av et Chalermprakiat-stipend fra Det medisinske fakultet Siriraj Hospital, Mahidol University. Forfatterne vil gjerne takke Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Fakultet for naturvitenskap, Mahidol University) for hennes hjelp med ITC-teknikken.
Materials
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
- Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
