Un modelo competente de hepatocitos que examina la entrada del virus de la hepatitis B a través del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio como objetivo terapéutico
Summary
Presentamos un protocolo para detectar compuestos contra el virus de la hepatitis B (VHB) dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada pre y post-viral, utilizando calorimetría de titulación isotérmica para medir la afinidad de unión (KD) con el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio del huésped. La eficacia antiviral se determinó a través de la supresión de los marcadores del ciclo de vida viral (formación de ADNcc, transcripción y ensamblaje viral).
Abstract
La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se ha considerado un factor de riesgo crucial para el carcinoma hepatocelular. El tratamiento actual solo puede disminuir la carga viral, pero no puede dar lugar a una remisión completa. Un modelo de hepatocitos eficiente para la infección por VHB ofrecería un ciclo de vida viral fiel a la vida que sería crucial para la detección de agentes terapéuticos. La mayoría de los agentes anti-VHB disponibles se dirigen a las etapas del ciclo de vida después de la entrada viral, pero no antes de la entrada viral. Este protocolo detalla la generación de un modelo de hepatocitos competente capaz de detectar agentes terapéuticos dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada previral y posterior a la entrada viral. Esto incluye la orientación de la unión del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (NTCP), la formación de cccDNA, la transcripción y el ensamblaje viral basado en imHC o HepaRG como células huésped. Aquí, el ensayo de inhibición de entrada del VHB utilizó curcumina para inhibir las funciones de unión y transporte del VHB a través de NTCP. Los inhibidores se evaluaron para determinar la afinidad de unión (KD) con NTCP utilizando calorimetría de titulación isotérmica (ITC), una herramienta universal para la detección de fármacos contra el VHB basada en parámetros termodinámicos.
Introduction
La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) se considera una enfermedad potencialmente mortal en todo el mundo. La infección crónica por VHB está cargada de riesgo de cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular1. El tratamiento actual contra el VHB se centra principalmente en la entrada después de la viral utilizando análogos de nucleólidos (NA) e interferón-alfa (IFN-α)2,3. El descubrimiento de un inhibidor de la entrada del VHB, Myrcludex B, ha identificado un nuevo objetivo para los agentes anti-VHB4. La combinación de inhibidores de entrada y NAs en el VHB crónico ha disminuido significativamente la carga viral en comparación con aquellos dirigidos a la replicación viral sola 5,6. Sin embargo, el modelo clásico de hepatocitos para el cribado de los inhibidores de la entrada al VHB está limitado por los bajos niveles de receptores virales (polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio, NTCP). La sobreexpresión de hNTCP en células hepatomas (es decir, HepG2 y Huh7) mejora la infectividad del VHB 7,8. Sin embargo, estas líneas celulares expresan bajos niveles de enzimas metabolizadoras de fármacos de fase I y II y exhiben inestabilidad genética9. Los modelos de hepatocitos que pueden ayudar a atacar distintos mecanismos de compuestos candidatos contra el VHB, como la entrada previral, la unión a NTCP y la entrada viral, acelerarían la identificación y el desarrollo de regímenes de combinación eficaces. El estudio de la actividad anti-VHB de la curcumina ha dilucidado la inhibición de la entrada viral como un nuevo mecanismo además de la interrupción posterior a la entrada viral. Este protocolo detalla un modelo de huésped para el cribado de moléculas de entrada anti-VHB10.
El objetivo de este método es explorar compuestos candidatos anti-VHB para la inhibición de la entrada viral, especialmente bloqueando la unión y el transporte de NTCP. Como la expresión de NTCP es un factor crítico para la entrada e infección del VHB, optimizamos el protocolo de maduración de hepatocitos para maximizar los niveles de NTCP11. Además, este protocolo puede diferenciar el efecto inhibitorio sobre la entrada del VHB como inhibición de la unión al VHB versus inhibición de la internalización. El ensayo de captación de ácido taurocólico (TCA) también se modificó utilizando un método basado en ELISA en lugar de un radioisótopo para representar el transporte NTCP12,13. La interacción receptor y ligando fue confirmada por sus estructuras 3D14,15. La inhibición de la función NTCP puede ser evaluada midiendo la actividad de captación de TCA16. Sin embargo, esta técnica no proporcionó evidencia directa de unión de NTCP a los inhibidores candidatos. Por lo tanto, la unión puede investigarse utilizando diversas técnicas, como la resonancia de plasmones de superficie17, ELISA, ensayo de desplazamiento térmico basado en fluorescencia (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen y varios otros métodos20. Entre estas técnicas, el ITC es un estándar objetivo en el análisis de unión porque puede observar la absorción o emisión de calor en casi todas las reacciones21. La afinidad de unión (KD) de NTCP y compuestos candidatos se evaluó directamente mediante ITC; Esos valores de afinidad fueron más precisos que los obtenidos utilizando el modelo de predicción in silico 22.
Este protocolo cubre técnicas de maduración de hepatocitos, infección por VHB y detección de inhibidores de la entrada de VHB. Brevemente, se desarrolló un modelo de hepatocitos basado en líneas celulares imHC y HepaRG. Las células cultivadas se diferenciaron en hepatocitos maduros en 2 semanas. La regulación positiva de los niveles de NTCP se detectó mediante PCR en tiempo real, western blot y citometría de flujo11. El virión de la hepatitis B (VHBcc) se produjo y recolectó de HepG2.2.15. El imHC o HepaRG diferenciado (d-imHC, d-HepaRG) fue tratado profilácticamente con los candidatos anti-VHB 2 h antes de la inoculación con virión VHB. El resultado esperado del experimento fue la identificación de los agentes que disminuyen el VHB celular y la infectividad. La actividad anti-NTCP se evaluó mediante el ensayo de captación de TCA. La actividad de NTCP podría ser suprimida por los agentes que se unieron específicamente a NTCP. La técnica ITC fue empleada para investigar la factibilidad de la unión interactiva que podría predecir inhibidores y sus proteínas diana, determinando la afinidad de unión (KD) del ligando para el receptor a través de interacciones no covalentes del complejo biomolecular23,24. Por ejemplo, K D ≥ 1 × 103 mM representa una unión débil, K D ≥ 1 × 106 μM representa una unión moderada y K D ≤ 1 × 109 nM representa una unión fuerte. El ΔG está directamente correlacionado con las interacciones de unión. En particular, una reacción con ΔG negativo es una reacción exergónica, lo que indica que la unión es un proceso espontáneo. Una reacción con un ΔH negativo indica que los procesos de unión dependen del enlace de hidrógeno y de las fuerzas de Van der Waals. Tanto la captación de TCA como los datos del ITC podrían utilizarse para detectar agentes de entrada anti-VHB. Los resultados de estos protocolos pueden proporcionar una base no solo para la detección contra el VHB, sino también para la interacción con NTCP evaluada a través de la afinidad vinculante y la función de transporte. Este documento describe la preparación y caracterización de la célula huésped, el diseño experimental y la evaluación de la entrada anti-VHB junto con la afinidad de unión a NTCP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La infección por VHB se inicia a través de la unión de baja afinidad a proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) en los hepatocitos25, seguida de la unión a NTCP con posterior internalización a través de endocitosis26. Como el NTCP es un receptor crucial para la entrada del VHB, la entrada dirigida al VHB puede traducirse clínicamente para disminuir la infección de novo , la transmisión maternoinfantil (MTCT) y la recurrencia después del trasplante de hí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto de investigación cuenta con el apoyo de la Universidad de Mahidol y la Investigación e Innovación Científica de Tailandia (TSRI) otorgados por separado a A. Wongkajornsilp y K. Sa-ngiamsuntorn. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Oficina del Consejo Nacional de Políticas de Investigación e Innovación en Ciencias de la Educación Superior a través de la Unidad de Gestión de Programas para la Competitividad (número de subvención C10F630093). A. Wongkajornsilp recibió una beca Chalermprakiat de la Facultad de Medicina del Hospital Siriraj de la Universidad de Mahidol. Los autores desean agradecer a la señorita Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Facultad de Ciencias, Universidad de Mahidol) por su ayuda con la técnica ITC.
Materials
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
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