Vi presenterar ett protokoll för att screena anti-hepatit B-virus (HBV) föreningar som riktar sig mot livscykelstadier före och efter viralt inträde, med hjälp av isotermisk titreringskalorimetri för att mäta bindningsaffinitet (KD) med värdnatriumtaurokolat som transporterar polypeptid. Antiviral effekt bestämdes genom undertryckande av virala livscykelmarkörer (cccDNA-bildning, transkription och viral sammansättning).
Hepatit B-virus (HBV) infektion har ansetts vara en avgörande riskfaktor för hepatocellulärt karcinom. Nuvarande behandling kan bara minska virusbelastningen men inte resultera i fullständig remission. En effektiv hepatocytmodell för HBV-infektion skulle erbjuda en verklighetstrogen viral livscykel som skulle vara avgörande för screening av terapeutiska medel. De flesta tillgängliga anti-HBV-agenter riktar in sig på livscykelstadier efter viral inträde men inte före viral inträde. Detta protokoll beskriver genereringen av en kompetent hepatocytmodell som kan screena för terapeutiska medel som riktar sig mot livscykelstadier före och efter viralt inträde. Detta inkluderar inriktning på natriumtaurokolat cotransporterande polypeptid (NTCP) bindning, cccDNA-bildning, transkription och viral sammansättning baserat på imHC eller HepaRG som värdceller. Här, HBV inträde hämning analys används curcumin för att hämma HBV bindning och transportera funktioner via NTCP. Hämmarna utvärderades för bindningsaffinitet (KD) med NTCP med hjälp av isotermisk titreringskalorimetri (ITC) – ett universellt verktyg för HBV-läkemedelsscreening baserat på termodynamiska parametrar.
Hepatit B-virus (HBV) infektion anses vara en livshotande sjukdom över hela världen. Kronisk HBV-infektion är laddad med risk för levercirros och hepatocellulärt karcinom1. Nuvarande anti-HBV-behandling fokuserar främst på postviral inträde med hjälp av nukleos(t)idanaloger (NA) och interferon-alfa (IFN-α)2,3. Upptäckten av en HBV-inträdeshämmare, Myrcludex B, har identifierat ett nytt mål för anti-HBV-medel4. Kombinationen av inträdeshämmare och NA i kronisk HBV har avsevärt minskat virusbelastningen jämfört med de som enbart riktar sig mot viral replikation 5,6. Den klassiska hepatocytmodellen för screening av HBV-inträdeshämmare begränsas emellertid av låga virala receptornivåer (natriumtaurokolat som transporterar polypeptid, NTCP). Överuttrycket av hNTCP i hepatomceller (dvs. HepG2 och Huh7) förbättrar HBV-smittsamheten 7,8. Icke desto mindre, dessa cellinjer uttrycker låga nivåer av fas I och II läkemedelsmetaboliserande enzymer och uppvisar genetisk instabilitet9. Hepatocytmodeller som kan hjälpa till att rikta in sig på distinkta mekanismer för kandidat-anti-HBV-föreningar såsom previral inträde, NTCP-bindning och viral inträde skulle påskynda identifieringen och utvecklingen av effektiva kombinationsregimer. Studien för anti-HBV aktivitet av curcumin har belyst hämningen av viral inträde som en ny mekanism utöver post viral inträde avbrott. Detta protokoll beskriver en värdmodell för screening av anti-HBV-ingångsmolekyler10.
Målet med denna metod är att utforska kandidat-anti-HBV-föreningar för virusinträdeshämning, särskilt blockering av NTCP-bindning och transport. Eftersom NTCP-uttryck är en kritisk faktor för HBV-inträde och infektion optimerade vi hepatocytmognadsprotokollet för att maximera NTCP-nivåerna11. Dessutom kan detta protokoll skilja den hämmande effekten på HBV-inträde som hämning av HBV-bindning kontra hämning av internalisering. Upptaget av taurokolsyra (TCA) modifierades också med hjälp av en ELISA-baserad metod i stället för en radioisotop för att representera NTCP-transport12,13. Receptor- och ligandinteraktionen bekräftades av deras 3D-strukturer14,15. Hämningen av NTCP-funktionen kan utvärderas genom att mäta TCA-upptagsaktivitet16. Denna teknik gav emellertid inte direkta bevis för NTCP-bindning till kandidathämmarna. Därför kan bindningen undersökas med hjälp av olika tekniker, såsom ytplasmonresonans17, ELISA, fluorescensbaserad termisk skiftanalys (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen och olika andra metoder20. Bland dessa tekniker är ITC en målstandard för bindande analys eftersom den kan observera värmeabsorption eller utsläpp i nästan varje reaktion21. Bindningsaffiniteten (KD) hos NTCP och kandidatföreningar utvärderades direkt med användning av ITC; Dessa affinitetsvärden var mer exakta än de som erhölls med hjälp av in silico prediction model22.
Detta protokoll täcker tekniker vid hepatocytmognad, HBV-infektion och screening för HBV-inträdeshämmare. Kortfattat utvecklades en hepatocytmodell baserad på imHC- och HepaRG-cellinjer. De odlade cellerna differentierades till mogna hepatocyter inom 2 veckor. Uppregleringen av NTCP-nivåer upptäcktes med hjälp av PCR, western blot och flödescytometrii realtid 11. Hepatit B-virion (HBVcc) producerades och samlades in från HepG2.2.15. Den differentierade imHC eller HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) behandlades profylaktiskt med anti-HBV-kandidaterna 2 h före inokuleringen med HBV-virion. Det förväntade resultatet av experimentet var identifieringen av de medel som minskar cellulär HBV och smittsamhet. Anti-NTCP-aktivitet utvärderades med hjälp av TCA-upptagsanalysen. NTCP-aktivitet kan undertryckas av de agenter som specifikt band NTCP. ITC-tekniken användes för att undersöka genomförbarheten av interaktiv bindning som kunde förutsäga hämmare och deras målproteiner, bestämma bindningsaffiniteten (KD) hos liganden för receptorn via icke-kovalenta interaktioner av det biomolekylära komplexet23,24. Till exempel representerar K D ≥ 1 × 103 mM svag bindning, K D ≥ 1 × 106 μM representerar måttlig bindning och K D ≤ 1 × 109 nM representerar stark bindning. ΔG är direkt korrelerad med bindande interaktioner. I synnerhet är en reaktion med negativ ΔG en exergonisk reaktion, vilket indikerar att bindning är en spontan process. En reaktion med en negativ ΔH indikerar att bindningsprocesserna beror på vätebindning och Van der Waals-krafter. Både TCA-upptag och ITC-data kan användas för att söka efter anti-HBV-ingångsagenter. Resultaten av dessa protokoll kan ge en grund för inte bara anti-HBV-screening utan också interaktionen med NTCP som bedöms genom bindande affinitet och transportfunktion. Detta dokument beskriver värdcellsberedning och karakterisering, experimentell design och utvärdering av anti-HBV-posten tillsammans med NTCP-bindningsaffiniteten.
HBV-infektion initieras via lågaffinitetsbindning till heparansulfatproteoglykaner (HSPG) på hepatocyter25, följt av bindning till NTCP med efterföljande internalisering genom endocytos26. Eftersom NTCP är en avgörande receptor för HBV-inträde kan riktad HBV-inträde kliniskt översättas till minskad de novo-infektion , mor-till-barn-överföring (MTCT) och återfall efter levertransplantation. Att avbryta virusinträde skulle vara ett genomförbart altern…
The authors have nothing to disclose.
Detta forskningsprojekt stöds av Mahidol University och Thailand Science Research and Innovation (TSRI) som tilldelas A. Wongkajornsilp och K. Sa-ngiamsuntorn. Detta arbete stöddes ekonomiskt av Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council genom Program Management Unit for Competitiveness (bidragsnummer C10F630093). A. Wongkajornsilp är mottagare av ett Chalermprakiat-bidrag från medicinska fakulteten Siriraj Hospital, Mahidol University. Författarna vill tacka fröken Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Naturvetenskapliga fakulteten, Mahidol University) för hennes hjälp med ITC-tekniken.
Cell lines | |||
HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
Reagents | |||
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
Antibodies | |||
Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
Reagent composition | |||
1° Antibody dilution buffer | |||
1x TBST | |||
3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
Hepatocyte Growth Medium | |||
DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
Hepatic maturation medium | |||
Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
IF Blocking solution | |||
1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
NaF | Final concentration: 10 mM | ||
Western blot reagent | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
1x TBST | |||
5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
1x Running buffer 1 L | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
Blot transfer buffer 500 mL | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
SDS | Merck | 7910 | 1 g |
Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
Equipments | |||
15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |