Lysat plasmatique riche en plaquettes pour le traitement des maladies de la surface oculaire

Summary

Les lysats plaquettaires représentent un outil émergent pour le traitement des maladies de la surface oculaire. Ici, nous proposons une méthode pour la préparation, la distribution, le stockage et la caractérisation du lysat plaquettaire prélevé sur des donneurs de plaquettes.

Abstract

Diverses maladies de la surface oculaire sont traitées avec des gouttes oculaires dérivées du sang. Leur utilisation a été introduite dans la pratique clinique en raison de leur teneur en métabolites et en facteurs de croissance, ce qui favorise la régénération de la surface oculaire. Les gouttes ophtalmiques à base de sang peuvent être préparées à partir de différentes sources (c.-à-d. don de sang total ou d’aphérèse plaquettaire), ainsi qu’avec différents protocoles (p. ex. différentes dilutions et cycles de congélation et de décongélation). Cette variabilité entrave la standardisation des protocoles cliniques et, par conséquent, l’évaluation de leur efficacité clinique. Le détail et le partage des procédures méthodologiques peuvent contribuer à la définition de lignes directrices communes. Au cours des dernières années, les produits allogéniques se sont diffusés comme alternative aux traitements autologues car ils garantissent des normes d’efficacité plus élevées; parmi eux, les gouttes ophtalmiques au lysat plasma riche en plaquettes (PRP-L) sont préparées selon des procédures de fabrication simples. Dans l’unité de médecine transfusionnelle de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, en Italie, le PRP-L est obtenu par don d’aphérèse plaquettaire. Ce produit est initialement dilué à 0,3 x 10 9 plaquettes/mL (à partir d’une concentration moyenne de 1 x 10 9 plaquettes/mL) dans^0,9% de NaCl. Les plaquettes diluées sont congelées/décongelées et, par la suite, centrifugées pour éliminer les débris. Le volume final est divisé en aliquotes de 1,45 mL et stocké à −80 °C. Avant d’être délivrés aux patients, les gouttes oculaires sont testées pour la stérilité. Les patients peuvent conserver les lysats plaquettaires à -15 °C jusqu’à 1 mois. La composition du facteur de croissance est également évaluée à partir d’aliquotes choisies au hasard, et les valeurs moyennes sont rapportées ici.

Introduction

Les produits dérivés du sang sont largement utilisés dans le soin des plaies¹, la chirurgie maxillo-faciale et orthopédique et pour le traitement de différentes maladies de la surface oculaire² telles que la sécheresse oculaire (DED)³. Dans la DED, l’homéostasie du film lacrymal est altérée en raison du fonctionnement anormal de différents facteurs impliqués dans la production de larmes et l’intégrité de la surface oculaire ^4,5.

La DED est caractérisée par une hétérogénéité dans les causes et la gravité ^6,7,8 et peut être une conséquence de différents facteurs comme le vieillissement, le sexe⁹, les lentilles de contact, les médicaments topiques ou systémiques 10^, ou des conditions préexistantes comme le syndrome de Gougerot-Sjögren ¹⁰. Malgré des symptômes bénins, la DED affecte des millions de personnes dans le monde, ce qui a un impact sur leur qualité de vie et sur le système de santé⁶.

De nombreux traitements ont été rapportés pour cette pathologie, mais il n’y a toujours pas de consensus sur la solution la plus efficace¹². À ce jour, les larmes artificielles sont la première ligne de traitement visant à restaurer la composition aqueuse du film lacrymal, bien que ces substituts ne contiennent pas les principaux solutés biologiquement actifs des larmes naturelles ^6,11. Les produits à base de plaquettes sont considérés comme une alternative valable^12,13 aux larmes artificielles^, bien que leur efficacité clinique, leurs recommandations d’utilisation et leurs méthodes de préparation fassent encore l’objet de débats³.

Les produits sanguins partagent avec les larmes une composition similaire en termes de métabolites¹⁴, protéines, lipides, vitamines, ions, facteurs de croissance (GF), composés antioxydants 11 et osmolarité (300 mOsm/L)¹¹. Grâce à l’activité synergique de leurs composants, ils favorisent la régénération de l’épithélium cornéen, inhibent la libération de cytokines inflammatoires et augmentent le nombre de cellules caliciformes et l’expression des mucines dans la conjonctive ^2,3.

Jusqu’à présent, l’hétérogénéité des produits ophtalmiques à base de sang a été documentée dans la littérature; Ces produits peuvent être classés selon l’origine du donneur de sang, c’est-à-dire autologue ou allogénique, ainsi que la source de sang, c’est-à-dire le sang périphérique, le sang de cordon, le sérum ou les plaquettes.

Bien que les produits autologues aient été les plus répandus³, les produits allogéniques deviennent maintenant le choix préféré, car ils garantissent des normes d’efficacité et de sécurité plus élevées 15, ainsi qu’une réduction significative des coûts^16,17. Des études antérieures ont en effet prouvé que les produits sanguins obtenus à partir de patients atteints de maladies auto-immunes et/ou systémiques peuvent présenter une altération de la qualité et de la fonctionnalité 6,16,17. Malgré le fait que les gouttes ophtalmiques à base de sérum soient les plus répandues, les produits à base de plaquettes se sont récemment affirmés comme une alternative valable, car ils peuvent être facilement préparés tout en maintenant des niveaux d’efficacité^{significatifs 3,11}. Les produits à base de plaquettes actuellement disponibles peuvent être divisés en plasma riche en plaquettes (PRP), en lysat de plasma riche en plaquettes (PRP-L) et en plasma riche en facteurs de croissance (PRGF)³.

Parmi eux, le PRP-L a l’avantage d’être un produit surgelé longue conservation. Le PRP-L peut être préparé à partir d’aphérèse, de couches leucocytaires ou même de plaquettes expirant (PLT)^18,19, ce qui réduit précieusement leur gaspillage. Les aliquotes peuvent être conservées pendant des mois dans les centres de transfusion sanguine à -80 °C ou même au domicile des patients à -15 °C pendant des périodes plus courtes.

Les PRP-L sont hautement enrichis en GF, dont il a été prouvé qu’ils stimulent la régénération de la surface oculaire 12,20,21. Néanmoins, il n’y a que peu d’études cliniques rapportées dans ce domaine, et toutes ont utilisé des sources autologues ^3,22. Le PRP-L doit encore faire l’objet d’une validation et d’une caractérisation plus poussées avant de pouvoir être utilisé systématiquement pour le traitement des maladies de la surface oculaire, car il n’existe pas de lignes directrices normalisées pour sa préparation, sa distribution et son entreposage³.

Ici, un protocole détaillé est partagé pour la production de PRP-L utilisé à l’unité de médecine transfusionnelle de l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, en Italie, et la dispensation aux patients atteints de DED. Notre objectif est d’aider la communauté scientifique à développer des méthodes de préparation standard, qui peuvent augmenter l’homogénéité et la cohérence des études et des approches cliniques mondiales.

Protocol

Le PRP-L utilisé pour l’évaluation quantitative des facteurs de croissance a été recueilli dans le cadre d’une étude plus large sur la caractérisation des produits PRP à des fins régénératives, réalisée à l’AUSL-IRCCS di Reggio Emilia et approuvée par le comité d’éthique Area Vasta Emilia Nord le 10 janvier 2019 (protocole numéro 2019/0003319). Les donateurs ont donné leur consentement éclairé conformément à la Déclaration d’Helsinki. Aucune approbation éthique n’était nécessaire pou…

Representative Results

La raison d’être de l’utilisation de gouttes ophtalmiques dérivées du sérum (qui est le produit sanguin le plus fréquemment utilisé pour le traitement des maladies de la surface oculaire) réside dans leur teneur en GF, qui sont presque entièrement dérivés des plaquettes circulantes. Le PRP contient un nombre significativement plus élevé de plaquettes (et, par conséquent, de GF dérivés des plaquettes) par rapport au sérum sanguin périphérique, allant de 0,15 x 10 9-0,45 x 109 PLT/mL.<…

Discussion

Ces dernières années, l’utilisation clinique de produits à base de plaquettes pour les pathologies de surface oculaire a augmenté, mais leur diffusion est entravée par le manque de robustesse scientifique. Cela est principalement dû à la grande hétérogénéité des sources de donneurs et des protocoles de préparation, qui ne sont souvent pas entièrement divulgués ou ne sont pas spécifiquement conçus aux fins pour lesquelles ils sont dispensés. En particulier, les informations sur les produits à base de …

Materials

Equipments
CompoSeal Mobilea II	Fresenius Kabi, Germany		bag sealer
HeraSafe hood	Heraeus Instruments, Germany		Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System	Haemonetics, Italy		automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i	Helmer, USA		Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator	MDS Nordion, Canada		X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS	Hettich Zentrifugen, Germany		High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i	Sysmex Europe GMBH, Germany		haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15	Falc Instruments, Italy		Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A	Fenwal Inc., USA	DIN 00788139	anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	BD 442020	Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials	BD Biosciences, USA	442020	At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe	BD Plastipack, USA	300865	At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1	BioRad Laboratories, USA	171AC500M	Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2	BioRad Laboratories, USA	171AC600M	Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader	BioRad Laboratories, USA	Magpix	This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay	BioRad Laboratories, USA	10024984	Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet	ARIES s.r.l., Italy	A2DH0020	At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube	BD Vacutainer, USA	367835	1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents	Biomed Device s.r.l., Italy	COLC50	Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC511	Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well	BioRad Laboratories, USA	171BC603M	Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution	Baxter S.p.A., Italy	B05BB01	1000 ml
OSDI Questionnaire	Allergan Inc., USA	OSDI	Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike	BioRet ARIES s.r.l., Italy	BS051004	Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+	TERUMO BCT Inc., Italy	40842	preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel	Microsoft, USA	Excel	Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*T100BM	1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml	TERUMO BCT Inc., Italy	BB*030CM	At least 6 for each PRP unit collected