वर्तमान प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन के अध्ययन का वर्णन करता है। स्टेफिलोकोकस ऑरियस बायोफिल्म विट्रो में स्थापित किए जाते हैं और परिधीय रक्त-व्युत्पन्न मानव न्यूट्रोफिल के साथ इनक्यूबेट किए जाते हैं। न्यूट्रोफिल से ऑक्सीडेटिव विस्फोट प्रतिक्रिया निर्धारित की जाती है, और बायोफिल्म के भीतर न्यूट्रोफिल स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जाता है।
न्यूट्रोफिल माइक्रोबियल संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा तैनात रक्षा की पहली पंक्ति है। विवो में, न्यूट्रोफिल को संक्रमण की साइट पर भर्ती किया जाता है जहां वे फागोसाइटोसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों (आरओएस, आरएनएस, क्रमशः), एनईटोसिस (न्यूट्रोफिल बाह्य जाल), और रोगाणुओं को मारने और संक्रमण को हल करने के लिए विघटन जैसी प्रक्रियाओं का उपयोग करते हैं। न्यूट्रोफिल और प्लवक रोगाणुओं के बीच बातचीत का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। हाल के वर्षों में बायोफिल्म के कारण होने वाले संक्रमणों का अध्ययन करने में रुचि उभर रही है। बायोफिल्म अपने प्लवक-विकसित समकक्षों से अलग न्यूट्रोफिल द्वारा हत्या के लिए सहिष्णुता सहित गुणों का प्रदर्शन करते हैं। इन विट्रो और विवो बायोफिल्म मॉडल दोनों की सफल स्थापना के साथ, विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ इन माइक्रोबियल समुदायों के बीच बातचीत की जांच की जा सकती है। यहां, पारंपरिक बायोफिल्म मॉडल और अच्छी तरह से स्थापित न्यूट्रोफिल गतिविधि परख के संयोजन का उपयोग करने वाली तकनीकों को विशेष रूप से न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए तैयार किया गया है। बायोफिल्म में न्यूट्रोफिल के स्थानीयकरण की निगरानी के लिए वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। ये बायोफिल्म स्थिर स्थितियों में उगाए जाते हैं, इसके बाद मानव परिधीय रक्त से प्राप्त न्यूट्रोफिल को जोड़ा जाता है। माइक्रोस्कोप के तहत विज़ुअलाइज़ेशन से पहले नमूने उचित रंगों से दाग दिए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, आरओएस का उत्पादन, जो रोगजनकों के खिलाफ कई न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं में से एक है, एक बायोफिल्म की उपस्थिति में निर्धारित किया जाता है। इस स्थापित प्रणाली में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अतिरिक्त इन प्रक्रियाओं को सटीक रूप से मापने के लिए मानकीकृत और अनुकूलित स्थितियों के उपयोग को सुनिश्चित करते हुए मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की समझ का विस्तार होगा।
एक बायोफिल्म सतह से जुड़े रोगाणुओं या गैर-संलग्न समुच्चय का एक समुदाय है जो एक बाह्य बहुलक पदार्थ (ईपीएस) 1,2 में संलग्न है। ये समुदाय एंटीमाइक्रोबियल एजेंटों और प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रति सहिष्णुता सहित पर्यावरणीय तनावों से घिरे सूक्ष्मजीवों की रक्षा करतेहैं। कई रोगजनक माइक्रोबियल प्रजातियां बायोफिल्म बनाती हैं जो पुराने संक्रमणसे जुड़ी हुई हैं। बायोफिल्म का विकास एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें सतहों से लगाव, ईपीएस उत्पादन, सेल प्रसार, बायोफिल्म संरचना और सेल डिटेचमेंट5 शामिल हैं। एक बार जब कोशिकाएं बायोफिल्म बनाने के लिए फैल जाती हैं, तो वे प्लवक रहते हैं या एक नए सबस्ट्रेटम में स्थानांतरित हो जाते हैं और बायोफिल्मविकास को फिर से शुरू करते हैं।
स्टेफिलोकोकस ऑरियस, एक अवसरवादी रोगज़नक़, बायोफिल्म विकास की एक सामान्य योजना का पालन करता है, जिसमें लगाव, प्रसार, परिपक्वता और फैलावशामिल हैं। ऑरियस बायोफिल्म में अनुलग्नक प्रक्रिया हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन, टेक्सोइक एसिड और माइक्रोबियल सतह घटकों द्वारा चिपकने वाले मैट्रिक्स अणुओं (एमएससीआरएएमएस) 8,9 को पहचानने के लिए निर्धारित की जाती है। ऑरियस का प्रसार शुरू होने के साथ, ईपीएस, जिसमें मुख्य रूप से पॉलीसेकेराइड, प्रोटीन, बाह्य डीएनए और टीचोइक एसिड होते हैं, का उत्पादन होता है। जैसा कि ईपीएस घटकों का उत्पादन किया जाता है, विभिन्न एक्सोएंजाइम और छोटे अणु भी उत्पादित होते हैं, जो बायोफिल्म 3-आयामी संरचना में योगदान करते हैं और डिटेचमेंट5 में सहायता करते हैं। एस ऑरियस विभिन्न पुराने संक्रमणों को स्थापित करने के लिए इस अत्यधिक समन्वित जीवन शैली का लाभ उठाता है, जिसमेंचिकित्सा उपकरणों के निवास के कारण संक्रमण भी शामिल है।
मेथिसिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस (एमआरएसए) केंद्रीय शिरापरक और मूत्र कैथेटर, कृत्रिम जोड़ों, पेसमेकर, यांत्रिक हृदय वाल्व और अंतर्गर्भाशयी उपकरणों जैसे चिकित्सा उपकरणों से संबंधित संक्रमणके प्रमुख कारणों में से एक है। इस तरह के संक्रमणों के दौरान, न्यूट्रोफिल कई रणनीतियों के माध्यम से रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए संक्रमण स्थल पर भर्ती होने वालीपहली मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं। इनमें फागोसाइटोसिस, डीग्रेनुलेशन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियां (आरओएस / आरएनएस) उत्पादन, या रोगजनकों को खत्म करने के लिए न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) की रिहाई शामिलहै।
रोगाणुओं के फागोसाइटोसिस पर आरओएस की उत्पत्ति न्यूट्रोफिल14 द्वारा प्रदर्शित प्रमुख रोगाणुरोधी प्रतिक्रियाओं में से एक है। फागोसाइटोसिस को बढ़ाया जाता है यदि रोगाणुओं को ऑप्सोनिन में लेपित किया जाता है, विशेष रूप से इम्युनोग्लोबुलिन और सीरम15 में पाए जाने वाले घटकों के पूरक। ऑप्सोनाइज्ड रोगाणुओं को तब न्यूट्रोफिल पर सेल सतह रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जाता है और घेर लिया जाता है, जिससे फागोसोम15 नामक एक कम्पार्टमेंट बनता है। न्यूट्रोफिल झिल्ली से जुड़े एनएडीपीएच-ऑक्सीडेज16 के माध्यम से फागोसोम में आरओएस उत्पन्न और जारी करते हैं। यह बहु-घटक एंजाइम कॉम्प्लेक्स आणविक ऑक्सीजन16 में इलेक्ट्रॉनों को स्थानांतरित करके सुपरऑक्साइड आयन उत्पन्न करता है। इसके अतिरिक्त, न्यूट्रोफिल इंड्यूसेबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (आईएनओएस) 17 की अभिव्यक्ति के माध्यम से आरएनएस भी उत्पन्न करते हैं। फागोसोम के भीतर इन उच्च सुपरऑक्साइड और नाइट्रिक ऑक्साइड कणों में व्यापक रोगाणुरोधी गतिविधियां होती हैं। वे एंजाइमों में धातु केंद्रों के साथ बातचीत कर सकते हैं और रोगज़नक़18,19,20,21 के न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकते हैं। कई रोगाणु एक बायोफिल्म जीवन शैली को अपनाते हैं और आरओएस22,23 द्वारा हत्या से बचने के लिए विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करते हैं। इस प्रकार, आरओएस की मात्रा निर्धारित करने के लिए न्यूट्रोफिल के साथ बायोफिल्म को जोड़ने वाले मानकीकृत परख लगातार परिणामों के लिए फायदेमंद हैं।
जबकि न्यूट्रोफिल आरओएस उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने जैसे परख, बायोफिल्म के लिए न्यूट्रोफिल की प्रतिक्रियाओं के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, बायोफिल्म के भीतर न्यूट्रोफिल की बातचीत की कल्पना करने की क्षमता भी एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में काम कर सकती है। माइक्रोस्कोपी के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग को अक्सर उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है जिनका उपयोग माइक्रोस्कोपी इमेजिंग विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। कुछ स्थितियों को अनुकूलित करने का लचीलापन सीमित है क्योंकि न्यूट्रोफिल अलगाव के बाद कोशिका मृत्यु से गुजर सकते हैं। इसके अलावा, बायोफिल्म को आमतौर पर न्यूट्रोफिल के अलावा प्रयोगात्मक सेट-अप से प्लवक आबादी को हटाने के लिए धोया जाता है। धोते समय, आंशिक बायोमास के नुकसान के कारण प्रतिकृति बायोफिल्म के बीच परिवर्तनशीलता उत्पन्न हो सकती है यदि बायोफिल्म को सतह पर शिथिल रूप से पालन किया जाता है।
मोटे तौर पर, न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए क्षेत्र में वर्तमान तरीकों में मुख्य रूप से माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री और कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीएफयू) गणना 24,25,26,27 शामिल हैं। माइक्रोस्कोपी में रंगों का उपयोग शामिल है जो या तो सीधे न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म को दाग देते हैं, या रोगाणुओं के खिलाफ विभिन्न न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं को लक्षित करते हैं जैसे कि नेट गठन, अपघटन और कोशिका मृत्यु25,28। इन प्रतिक्रियाओं का एक उप-समूह, जैसे कि न्यूट्रोफिल कोशिका मृत्यु और अपघटन, का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से भी किया जा सकता है, लेकिन न्यूट्रोफिल को बायोफिल्म28,29 में रोगाणुओं के बड़े समुच्चय के साथ अधिमानतः असंबद्ध करने की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्री कुछ बायोफिल्म मापदंडों को भी निर्धारित कर सकती है, जैसे कि सेल व्यवहार्यता27। हालांकि, इन प्रक्रियाओं को बायोफिल्म बायोमास के विघटन की आवश्यकता होती है और बायोफिल्म 27,29,30 के भीतर न्यूट्रोफिल और उनके घटकों के स्थानिक वितरण जैसे अन्य महत्वपूर्ण इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए उपयोगी नहीं होगा।
वर्तमान प्रोटोकॉल बायोफिल्म पर न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक रूप से उपयोग किए जाने वाले कुछ तरीकों को अपनाने पर केंद्रित है जिन्हें हैंडलिंग के दौरान न्यूनतम परिवर्तनशीलता प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया गया है। यह प्रोटोकॉल इस प्रकार बायोफिल्म को विकसित करने और मात्रा निर्धारित करने, परिधीय रक्त से प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल को अलग करने, आरओएस उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से बायोफिल्म-न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए मानकीकृत तरीके प्रदान करता है। दाता पूल के बीच विषमता पर विचार करते हुए बायोफिल्म-न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन को समझने के लिए इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
विट्रो 48,49,50 में डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एस ऑरियस बायोफिल्म विकसित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। एक मानकीकृत प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है जो पीएलएल की धनिक प्रकृति का लाभ उठाता है, साथ ही मजबूत इन विट्रो एस ऑरियस बायोफिल्म के विकास के लिए ग्लूकोज के साथ मीडिया को पूरक करता है। पीएलएल के अलावा सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पीएलएल लेपित सतहों के लिए नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए बैक्टीरियल सेल के बेहतर लगाव की अनुमति देता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि 10 μg / mL सांद्रता पर PLL में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, एस्चेरिचिया कोलाई और एस ऑरियस के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि होती है जब 24 घंटे51 के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। सतहों को कोट करने के लिए एक ही एकाग्रता का उपयोग किया जाता है; हालांकि, अतिरिक्त पीएलएल एस्पिरेटेड होता है, जिससे बायोफिल्म विकास के लिए बीज बोते समय पीएलएल की एकाग्रता 10 μg / mL से कम हो जाती है।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पीएलएल ने केवल विशिष्ट विकास मीडिया में काम किया है जैसे कि 2% ग्लूकोज के साथ एमईएम, जहां यह देखा गया कि एस ऑरियस ने न्यूनतम परिवर्तनशीलता के साथ मजबूत बायोफिल्म का उत्पादन किया (चित्रा 2 ए)। अन्य मीडिया प्रकारों के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने वाले पीएलएल एकाग्रता को आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी, जैसे कि कुओं को कोट करने के लिए पीएलएल की बढ़ी हुई एकाग्रता का उपयोग करना। इसके अतिरिक्त, इन स्थितियों को एक मोनोप्रजाति एस ऑरियस बायोफिल्म के लिए अनुकूलित किया गया है। जबकि पुरानी घाव बायोफिल्म अक्सर पॉलीमाइक्रोबियल होते हैं, मोनोप्रजाति बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ इसकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए परखको मानकीकृत करना रोगजनन में उनके योगदान को समझने में महत्वपूर्ण है। इन मानकीकृत प्रोटोकॉल को पॉलीमाइक्रोबियल बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल के साथ उनकी बातचीत को बनाए रखने और अध्ययन करने के लिए और अनुकूलित किया जा सकता है।
यह भी देखा गया कि टीएसबी जैसे समृद्ध जीवाणु संस्कृति मीडिया ने न्यूट्रोफिल व्यवहार्यता का नुकसान किया (चित्रा 1)। इसलिए, स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों के लिए उपयोग किए जाने वाले एमईएम में एस ऑरियस बायोफिल्म की विकास स्थितियों को अनुकूलित किया गया था। न्यूट्रोफिल से जुड़े अध्ययनों के लिए, यह मीडिया न्यूट्रोफिल व्यवहार्यता का समर्थन करता है और एस ऑरियस विकास को बढ़ावा देता है। जबकि यह देखा गया कि मीडिया न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, यह विचार करना भी महत्वपूर्ण है कि परिधीय मानव रक्त से पृथक न्यूट्रोफिल 20 घंटे53 तक लगभग 70% एपोप्टोटिक न्यूट्रोफिल के साथ एपोप्टोसिस एक्स विवो से गुजरते हैं। इसके लिए उचित हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जैसे कि प्रयोगों की तैयारी करते समय बर्फ पर न्यूट्रोफिल को संग्रहीत करना, एंडोटॉक्सिन-मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करना, और न्यूट्रोफिल के साथ नमूनों के भंवर से बचकर न्यूट्रोफिल के सक्रियण को रोकना।
न्यूट्रोफिल में ऑक्सीडेटिव विस्फोट का आकलन नियमित रूप से रोगज़नक़14,54,55 पर न्यूट्रोफिल के हत्या प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। ये अध्ययन अक्सर प्लवक बैक्टीरिया के साथ किए जाते हैं जहां न्यूट्रोफिल जोड़े जाते हैं, और ऑक्सीडेटिव विस्फोट प्रतिक्रिया को ल्यूमिनोल-प्रवर्धित केमिलुमिनेसेंस का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है जो न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पादित सुपरऑक्साइड आयनों का पता लगाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल को प्लवक बैक्टीरिया को स्थिर रूप से उगाए गए 18 एच एस ऑरियस बायोफिल्म के साथ बदलकर संशोधित किया गया है। जैसे, न्यूट्रोफिल को उनके सक्रियण का आकलन करने के लिए सीधे बायोफिल्म में जोड़ा जा सकता है। दूसरी ओर, बायोफिल्म में बैक्टीरिया आरओएस 23,56 को डिटॉक्सिफाई करने के लिए कैटालेज और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज जैसेएंजाइमों का उत्पादन करते हैं। स्टेफिलोकोकस एपिडर्मिडिस बायोफिल्म तनाव57 के तहत अपने प्लवक समकक्ष की तुलना में उच्च कैटालेज का उत्पादन करते हैं। ऑरियस बायोफिल्म में पीएमए-उत्तेजित न्यूट्रोफिल का कुल केमिलुमिनेसेंस पीएमए-उत्तेजित न्यूट्रोफिल की तुलना में काफी कम है जहां बायोफिल्म अनुपस्थित है (चित्रा 2)। यह इन डिटॉक्सिफाइंग एंजाइमों की गतिविधि के कारण हो सकता है। ऑरियस बायोफिल्म ल्यूकोसिडिन नामक कई छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों का उत्पादन करते हैं जो न्यूट्रोफिल58 को मारते हैं। एस ऑरियस बायोफिल्म की उपस्थिति में न्यूट्रोफिल की कम व्यवहार्यता के कारण कम विस्फोट प्रतिक्रिया की भी संभावना है। जबकि यह अध्ययन ल्यूमिनोल का उपयोग करता है जो कोशिकाओं के अंदर और बाहर दोनों उत्पादित कुल आरओएस का पता लगाता है, अन्य अभिकर्मकों, जैसे कि सीएम-एच2डीसीएफडीए (5-(और -6)-क्लोरोमेथिल-2’7′-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट) या आइसोलुमिनोल पर विचार करने की आवश्यकता है यदि काम का लक्ष्य विशेष रूप से इंट्रासेल्युलर या बाह्य आरओएस उत्पादन 14,53,54 का अध्ययन करना है।
माइक्रोस्कोपी के माध्यम से न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन की कल्पना करने की क्षमता एक दूसरे की उपस्थिति में न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म के व्यवहार के बारे में जानकारीपूर्ण हो सकती है। फ्लोरोसेंट रंजक और प्रोटीन के उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 30 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद 18 एच एस ऑरियस बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल के बीच बातचीत का एक स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करते हैं। दाग वाली कोशिकाओं से संकेतों को प्रभावी ढंग से पकड़ने के लिए, माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने स्थापित करते समय प्रकाश स्रोतों के लिए नमूनों के जोखिम को सीमित करना महत्वपूर्ण है। इमेजिंग करते समय, विभिन्न चैनलों के लिए जेड-स्टैक ऊंचाई और एक्सपोजर समय जैसे सभी मापदंडों को समायोजित करते समय प्रकाश स्रोत की तीव्रता को कम करके नमूनों के तेजी से फोटोब्लीचिंग से बचा गया था।
इन सरल प्रथाओं ने उचित माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए अनुमति दी जहां यह देखा गया कि कुछ न्यूट्रोफिल बायोफिल्म (चित्रा 4 ए) के भीतर स्थानीयकृत हैं। यह बायोफिल्म के भीतर मौजूद रिक्त स्थान के कारण हो सकता है क्योंकि 2% ग्लूकोज के साथ एमईएम में उगाया गया 18 एच एस ऑरियस बायोफिल्म सतह को समान रूप से कवर नहीं करता है (चित्रा 4 बी)। हालांकि, समृद्ध मीडिया के अन्य अध्ययनों के उपयोग ने बायोफिल्म30,58 के माध्यम से प्रवेश करने वाले एस ऑरियस बायोफिल्म विकास और ल्यूकोसाइट्स का एक समान लॉन दिखाया है। इसके अलावा, यह भी देखा गया है कि एस ऑरियस बायोफिल्म-उत्पादित ल्यूकोसिडिन के कारण एस ऑरियस बायोफिल्म के साथ 30 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद न्यूट्रोफिल कोशिका मृत्यु हो गई थी जो न्यूट्रोफिल58 (चित्रा 4 ए, डी) को लाइज करती है। 30 मिनट के लिए बायोफिल्म के साथ उन्हें इंजेक्ट करने के बाद गैर-पालन न्यूट्रोफिल को हटाने के लिए एक वॉश स्टेप के अलावा, बिना धोए गए समूह की तुलना में सिस्टम से मृत न्यूट्रोफिल का ~ 15% हटा दिया गया, जिसमें माइक्रोस्कोपी इनक्यूबेशन के 30 मिनट के तुरंत बाद की गई थी (चित्रा 4 डी)। एस ऑरियस के साथ बातचीत करने वाले न्यूट्रोफिल भी देखे गए (चित्रा 4 सी)। यह आकलन करने के लिए आगे के प्रयोगों की आवश्यकता है कि क्या एस ऑरियस न्यूट्रोफिल से घिरा हुआ है या न्यूट्रोफिल54 की कोशिका सतह से जुड़ा हुआ है। इमेजिंग न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म डाउनस्ट्रीम कई न्यूट्रोफिल कार्यक्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए पहला कदम है, जैसे फागोसाइटोसिस और एनईटोसिस54,59। चरण 5.6 में सूचीबद्ध छवि विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके बायोफिल्म बायोमास, बायोफिल्म के संरचनात्मक परिवर्तन, और बायोफिल्म व्यवहार्यता को कई अन्य लोगों के बीच निर्धारित करके बायोफिल्म पर न्यूट्रोफिल के प्रभाव का भी आकलन किया जा सकता है। अंत में, न्यूट्रोफिल में दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता मौजूद है; इस प्रकार, यह अनुशंसा की जाती है कि न्यूट्रोफिल से जुड़े अध्ययनों के लिए कम से कम तीन अलग-अलग दाताओं का उपयोग किया जाए।
कुल मिलाकर, न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए मानकीकृत इन विट्रो परख ों को जोड़ा गया था। हालांकि ये परख एस ऑरियस का उपयोग करते हैं, वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विवो मॉडल में विभिन्न हैं, वे महंगे और श्रम-गहन हो सकते हैं, खासकर अगर स्थितियों को अनुकूलित नहीं किया जाता है। मानकीकृत इन विट्रो परखों के साथ काम करने से प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करने और इनविवो सिस्टम में जाने से पहले टिप्पणियों की पुष्टि करने की अनुमति मिलती है। अंत में, विवो में बायोफिल्म-न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न पशु संक्रमण मॉडल का उपयोग किया गया है। हालांकि, मनुष्यों और पशु मॉडल60,61,62,63 के बीच प्रतिरक्षात्मक अंतर पर विचार करना महत्वपूर्ण है। इसके लिए इन जटिल मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए मनुष्यों से प्राप्त न्यूट्रोफिल का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को डीजेडब्ल्यू के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इंफेक्शियस डिजीज (आर01एआई077628) और ईएसजी को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड (19सीडीए 34630005) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम यूएसए 300 एलएसी जीएफपी स्ट्रेन प्रदान करने के लिए डॉ पॉल स्टैंडली को धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम कैंपस माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सुविधा (सीएमआईएफ) और ओएसयू व्यापक कैंसर केंद्र (ओएसयूसीसी) माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन (एमएसआर), ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी से संसाधनों को स्वीकार करते हैं। हम ब्लड ड्रॉ करने के लिए स्टैंडली लैब से अमेलिया स्टैट्स, पीटर बरबैक और लिसा कोलमैन को भी धन्यवाद देते हैं।
0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
Band-aids | Used for blood draw | ||
BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
Hemacytometer | Bright Line | ||
Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
Luminol | Sigma | A8511-5G | |
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Turnicate | Used for blood draw | ||
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |