Studien av sårheling forbundet med muskel- og skjelettskader krever ofte vurdering av in vitro interaksjoner mellom Schwann-celler (SCer), keratinocytter og fibroblaster. Denne protokollen beskriver isolasjon, dyrking og karakterisering av disse primære cellene fra den menneskelige forhuden.
Denne protokollen beskriver isolasjonsmetoder, fortykningsforhold og karakterisering av menneskelige primærceller med høyt utbytte og levedyktighet ved hjelp av rask enzymatisk dissosiasjon av huden. Primære keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler høstes alle fra det nyfødte forhuden, som er tilgjengelig etter standard omsorgsprosedyrer. Den fjernede huden desinfiseres, og det subkutane fettet og muskelen fjernes ved hjelp av en skalpell. Metoden består av enzymatisk og mekanisk separasjon av epidermale og dermale lag, etterfulgt av ytterligere enzymatisk fordøyelse for å oppnå encellede suspensjoner fra hvert av disse hudlagene. Til slutt vokser enkeltceller i passende cellekulturmedier etter standard cellekulturprotokoller for å opprettholde vekst og levedyktighet over uker. Sammen tillater denne enkle protokollen isolasjon, culturing og karakterisering av alle tre celletyper fra et enkelt stykke hud for in vitro-evaluering av hudnervemodeller. I tillegg kan disse cellene brukes sammen i samkulturer for å måle deres effekter på hverandre og deres respons på in vitro traumer i form av riper utført robotisert i kulturen forbundet med sårheling.
Primærceller avledet fra levende vev og dyrket under in vitro-forhold ligner nært på den fysiologiske tilstanden1, noe som gjør dem til en ideell modell for å undersøke fysiologiske og patofysiologiske prosesser. Huden inneholder flere celletyper, inkludert keratinocytter, fibroblaster, sebocytter, melanocytter og Schwann-celler (SCer), som kan isoleres og dyrkes for in vitro-eksperimenter . Metoder for å isolere og dyrke keratinocytter, fibroblaster og SCer, fra et enkelt stykke hud, har ikke blitt beskrevet. Målet med denne protokollen er todelt: 1) å etablere en pålitelig og reproduserbar metode for isolering og dyrking av dermale SCer og 2) å bruke en effektiv, robust metode for isolering av keratinocytter, fibroblaster og SCer fra et enkelt menneskelig forhud.
For tiden er det etablerte protokoller for å isolere hud keratinocytter 2,3,4 og fibroblaster 5,6. Disse studiene beskriver isolasjonen av enten keratinocytter, fibroblaster eller begge deler fra huden, men ingen protokoll tar for seg hvordan man etablerer kulturer av primære SCer fra menneskelig hud. Nyere studier tyder på at nevronale SCs modulerer keratinocytt og fibroblast cellulære prosesser og regulerer normale hudfysiologiske funksjoner7. SCs er dermed kritiske for huden homeostase og bidrar vesentlig til regulere fysiologi som påvirker oppførselen til nærliggende hudcelletyper tilstede8. Derfor er en protokoll som tillater isolering av hver av disse celletypene, ideell for in vitro-eksperimenter som involverer cellecellekommunikasjon eller kryssprat mellom celletyper.
Denne protokollen beskriver etableringen av individuelle cellekulturer av primærceller fra et enkelt stykke hud. Denne protokollen er spesielt nyttig når mengden vev som er tilgjengelig er begrenset. Videre tillater isolasjon av alle tre celletyper fra en enkelt donor robuste sammenligninger mellom celletyper eller samkultureksperimenter samtidig som genetikken reduseres under ønsket eksperiment.
Denne protokollen beskriver en metode for å isolere tre forskjellige cellepopulasjoner fra en enkelt del av forhuden, nemlig keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler. Det er noen få isolasjonsprotokoller tilgjengelig for å isolere keratinocytter og fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolasjon. Bortsett fra de viktigste strukturelle cellene i huden, keratinocytter og fibroblas…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Dr. Fadia Kamal, og Dr. Reyad Elbarbary for at vi kunne bruke laboratorieinstrumenter og teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (K08 AR060164-01A) og DOD (W81XWH-16-1-0725) til J. C. E. i tillegg til institusjonell støtte fra Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
T25 culture flask | Corning | 353109 | |
Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |