Studien av sårläkning i samband med muskuloskeletal skada kräver ofta bedömning av in vitro-interaktioner mellan Schwann-celler (SC), keratinocyter och fibroblaster. Detta protokoll beskriver isolering, odling och karakterisering av dessa primära celler från den mänskliga förhuden.
Detta protokoll beskriver isoleringsmetoder, odlingsförhållanden och karakterisering av humana primära celler med högt utbyte och livskraft med hjälp av snabb enzymatisk dissociation av huden. Primära keratinocyter, fibroblaster och Schwann-celler skördas alla från den mänskliga nyfödda förhuden, som är tillgänglig enligt standardvårdsprocedurer. Den borttagna huden desinficeras och det subkutana fettet och muskeln avlägsnas med en skalpell. Metoden består av enzymatisk och mekanisk separation av epidermala och dermala lager, följt av ytterligare enzymatisk matsmältning för att erhålla encellssuspensioner från vart och ett av dessa hudskikt. Slutligen odlas enstaka celler i lämpliga cellodlingsmedier enligt standardcellodlingsprotokoll för att upprätthålla tillväxt och livskraft under veckor. Tillsammans möjliggör detta enkla protokoll isolering, odling och karakterisering av alla tre celltyperna från en enda hudbit för in vitro-utvärdering av hudnervmodeller. Dessutom kan dessa celler användas tillsammans i samkulturer för att mäta deras effekter på varandra och deras svar på in vitro-trauma i form av repor som utförs robotiskt i kulturen i samband med sårläkning.
Primära celler som härrör från levande vävnad och odlas under in vitro-förhållanden liknar det fysiologiska tillståndet1, vilket gör dem till en idealisk modell för att undersöka fysiologiska och patofysiologiska processer. Huden innehåller flera celltyper, inklusive keratinocyter, fibroblaster, sebocyter, melanocyter och Schwann-celler (SC), som kan isoleras och odlas för in vitro-experiment . Metoder för att isolera och odla keratinocyter, fibroblaster och SC, från en enda hudbit, har inte beskrivits. Målet med detta protokoll är tvåfaldigt: 1) att upprätta en tillförlitlig och reproducerbar metod för isolering och odling av dermala SC och 2) att använda en effektiv, robust metod för isolering av keratinocyter, fibroblaster och SC från en enda human förhud.
För närvarande finns det etablerade protokoll för att isolera hud keratinocyter 2,3,4 och fibroblaster 5,6. Dessa studier beskriver isoleringen av antingen keratinocyter, fibroblaster eller båda från huden, men inget protokoll behandlar hur man etablerar kulturer av primära SC från mänsklig hud. Nya studier tyder på att neuronala SC modulerar keratinocyt- och fibroblastcellulära processer och reglerar normala hudfysiologiska funktioner7. SCs är således kritiska för hudhomeostas och bidrar väsentligt till regleringsfysiologin som påverkar beteendet hos närliggande hudcelltyper närvarande8. Därför är ett protokoll som möjliggör isolering av var och en av dessa celltyper idealiskt för in vitro-experiment som involverar cell-cellkommunikation eller korsprat mellan celltyper.
Detta protokoll beskriver upprättandet av enskilda cellkulturer av primära celler från en enda hudbit. Detta protokoll är särskilt användbart när mängden tillgänglig vävnad är begränsad. Dessutom möjliggör isolering av alla tre celltyperna från en enda givare robusta jämförelser mellan celltyper eller samodlingsexperiment samtidigt som man mildrar genetikens inflytande under det önskade experimentet.
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera tre distinkta cellpopulationer från en enda bit av förhuden, nämligen keratinocyter, fibroblaster och Schwann-celler. Det finns några isoleringsprotokoll tillgängliga för att isolera keratinocyter och fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolering. Bortsett från de viktigaste strukturella cellerna i hud, keratinocyter och fibrob…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr. Fadia Kamal och Dr. Reyad Elbarbary för att vi fick använda labbinstrument och teknisk support. Detta arbete stöddes av bidrag från NIH (K08 AR060164-01A) och DOD (W81XWH-16-1-0725) till J. C. E. förutom institutionellt stöd från Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
T25 culture flask | Corning | 353109 | |
Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |