Mikroskopiteknikker til fortolkning af svampekolonisering i mycoheterotrofiske plantevæv og symbiotisk spiring af frø

Summary

Denne protokol har til formål at give detaljerede procedurer til indsamling, fiksering og vedligeholdelse af mycoheterotrofe planteprøver ved anvendelse af forskellige mikroskopiteknikker såsom scanning og transmissionselektronmikroskopi, lys-, konfokal og fluorescensmikroskopi for at studere svampekolonisering i plantevæv og frø spiret med mycorrhizal svampe.

Abstract

Strukturel botanik er et uundværligt perspektiv for fuldt ud at forstå økologi, fysiologi, udvikling og udvikling af planter. Når man forsker i mycoheterotrofe planter (dvs. planter, der får kulstof fra svampe), kan bemærkelsesværdige aspekter af deres strukturelle tilpasninger, mønstre af vævskolonisering af svampe og underjordiske organers morfoanatomi oplyse deres udviklingsstrategier og deres forhold til hyfer, kilden til næringsstoffer. En anden vigtig rolle af symbiotiske svampe er relateret til spiring af orkidéfrø; alle Orchidaceae-arter er mycoheterotrofe under spiring og frøplantestadium (indledende mycoheterotrofi), selv dem, der fotosyntetiserer i voksne stadier. På grund af manglen på ernæringsmæssige reserver i orkidéfrø er svampesymbionter afgørende for at tilvejebringe substrater og muliggøre spiring. Analyse af spiringsstadier ved strukturelle perspektiver kan også besvare vigtige spørgsmål vedrørende svampeinteraktionen med frøene. Forskellige billeddannelsesteknikker kan anvendes til at afsløre svampeendofytter i plantevæv, som det foreslås i denne artikel. Frihånd og tynde sektioner af planteorganer kan farves og derefter observeres ved hjælp af lysmikroskopi. En fluorokrom, der er konjugeret til hvedekimagglutinin, kan påføres svampene og co-inkuberes med Calcofluor White for at fremhæve plantecellevægge i konfokal mikroskopi. Derudover er metoderne til scanning og transmissionselektronmikroskopi detaljeret for mycoheterotrofe orkideer, og mulighederne for at anvende sådanne protokoller i beslægtede planter undersøges. Symbiotisk spiring af orkidéfrø (dvs. i nærvær af mycorrhizal svampe) er beskrevet i protokollen detaljeret sammen med muligheder for at forberede strukturerne opnået fra forskellige spiringsstadier til analyser med lys-, konfokal og elektronmikroskopi.

Introduction

Strukturel forskning i botanik, der dækker plantemorfologi og anatomi, er grundlæggende for at forstå hele organismen^1,2 og giver uundværlige perspektiver til at integrere og bidrage til viden om økologi, fysiologi^, udvikling og udvikling af planter³. Metoder inden for plantemorfologi og anatomi omfatter i øjeblikket protokoller, udstyr og viden, der er udviklet for nylig såvel som for mere end et århundrede siden². Den kontinuerlige udførelse og tilpasning af klassiske metoder (f.eks. lysmikroskopi) sammen med nyere teknikker (f.eks. konfokal mikroskopi, røntgenmikrotomografi) har det samme væsentlige grundlag: teoretisk viden, der muliggør udvikling af en metode.

Det vigtigste værktøj i planteanatomi og morfologi er billedet. På trods af den misforståelse, at sådanne analyser er enkle observationer, der giver plads til subjektive fortolkninger², kræver analyse og forståelse af billeder på dette område kendskab til de anvendte metoder (udstyr, analysetype, metodologiske procedurer), cellekomponenter, histokemi og plantekroppen (vævsorganisation og funktion, ontogeni, morfologiske tilpasninger). Fortolkning af de billeder, der er opnået via en række forskellige metoder, kan føre til korrelering af form og funktion, dechifrering af en strukturs kemiske sammensætning, bekræftelse af beskrivelse af taxa, forståelse af infektioner med fytopatogener og andre sådanne vurderinger.

Når man forsker i mycoheterotrofe (MH) planter (dvs. ikke-fotosyntetiske planter, der opnår kulstof fra mycorrhizal svampe^4,5), kan bemærkelsesværdige aspekter af deres strukturelle tilpasninger, mønstre af vævskolonisering af svampe og underjordiske organers morfoanatomi oplyse deres udviklingsstrategier og forhold til hyfer^, som er kilden til næringsstoffer. De underjordiske organer af MH-planter viser normalt vigtige tilpasninger relateret til deres tilknytning til jordsvampe, og det er derfor vigtigt at udføre disse anatomiske og morfologiske undersøgelser⁶. MH-arters luftorganer bør ikke ignoreres, da endofytter også kan være til stede i disse væv, selvom de ikke er mycorrhizal svampe (personlige observationer, ikke offentliggjort endnu).

Udover den veletablerede væsentlighed af mycorrhizal svampe tilknytning til MH-arter i hele deres livscyklus⁷, har hver orkidéart, selv de autotrofiske, et indledende obligatorisk mycoheterotrofisk stadium i naturlige miljøer. Det opstår, fordi orkideernes embryo er udifferentieret og mangler endosperm eller cotyledoner, hvilket er ude af stand til at udvikle sig og etablere sig i naturlige miljøer uden ernæringsmæssig støtte fra svampepartnere ^4,8. I betragtning af at symbiotiske spiringsprotokoller ikke kun kan anvendes på MH-arter, men også på fotosyntetiserende orkideer, der sigter mod at undersøge orkidésvampspecificitet i spiring og protocormudvikling, en meget anvendt metode i initiativer til bevarelse af truede arter 9,10,11.

I denne metodesamling beskriver vi vigtige trin involveret i indsamling, fiksering og opbevaring af MH-planteprøver til anatomiske undersøgelser (afsnit 1), overfladeanalyse og prøveudvælgelse (afsnit 2), sektionsmetoder (frihånd: afsnit 3, mikrotomi: afsnit 4, kryomikrotomi: sektion 5), farvning og montering (afsnit 6), fluorescens og konfokal mikroskopi af svampeendofytter (afsnit 7), scanningselektronmikroskopi (afsnit 8), og transmissionselektronmikroskopi (afsnit 9). Derudover beskriver vi en symbiotisk spiringsmetode til orkidéfrø (MH og autotrofisk, afsnit 10), da de tidligere nævnte billeddannelsesmetoder med succes kan anvendes til at analysere svampekolonisering af frø, protocormer og frøplanter i spiringsprocessen.

Figur 1: Skematisk opsummering af billeddannelsesmetoder. Skemaerne giver indikationer af protokoltrin, hvor de er detaljerede. Forkortelser: GMA = glycolmethacrylat, OCT = optimal skæretemperaturforbindelse, SEM = scanningselektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

De mikroskopiteknikker, der er beskrevet her i detaljer (figur 1), indledes med følgende væsentlige trin: indsamling, fiksering, dehydrering, indlejring og sektionering af prøver. Da trinene er variable (figur 1) afhængigt af den eller de valgte teknikker, er det vigtigt at tænke fremad i betragtning af de fikseringsmidler, der skal fremstilles og transporteres til indsamlingsstedet, hvordan prøverne skal forberedes inden fastgørelse, de dehydreringsprocesser, der skal anvendes (afsnit 1), og forskellige indlejringsmuligheder og sektioneringsmetoder (afsnit 4, 5, og 9). Figur 1 opsummerer sekventielt alle de trin, der kræves for hver mikroskopiteknik, der er grundigt beskrevet nedenfor.

Protocol

1. Indsamling, fastsættelse og vedligeholdelse af prøver BEMÆRK: Fuldt MH-planter kan normalt findes i den mørke skovundergrund 12,13, hovedsageligt i fugtige og kuldrige, mens delvist MH-planter kan findes i mere åbne skove 12,13. MH-planter har normalt veludviklede underjordiske organer i forskellige former og størrelser. Når du samler MH-art…

Representative Results

Efter de væsentlige stadier af fastgørelse af plantevæv giver cellulære strukturer så ens som muligt til den levende tilstand i betragtning af morfologien, volumen og rumlig organisering af cellulære komponenter og væv16. Overhold sådanne træk i prøverne efter kemisk fiksering (figur 4). Figur 4C-F repræsenterer tilstrækkeligt faste prøver under lysmikroskopi. Efter de beskrevne fikseringspro…

Discussion

Billedanalyser i planteanatomi og morfologi har et vigtigt potentiale til at opfylde mål og hjælpe med at forstå forholdet mellem mycoheterotrofe planter og deres uundværlige svampeendofytter, som det fremgår af undersøgelser af underjordiske organer 6,40^, strukturelle analyser af symbiotisk spiring af frø³⁹ og luft- og reproduktionsstrukturer ⁴¹ . Strukturel botanik, på trods af at have mistet sin prestige …

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation – OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation – OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation – OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)