Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Abstract

Strukturelle Botanik ist eine unverzichtbare Perspektive, um die Ökologie, Physiologie, Entwicklung und Evolution von Pflanzen vollständig zu verstehen. Bei der Erforschung mykoheterotropher Pflanzen (d.h. Pflanzen, die Kohlenstoff aus Pilzen gewinnen) können bemerkenswerte Aspekte ihrer strukturellen Anpassungen, die Muster der Gewebebesiedlung durch Pilze und die Morphoanatomie unterirdischer Organe ihre Entwicklungsstrategien und ihre Beziehungen zu Hyphen, der Quelle von Nährstoffen, aufklären. Eine weitere wichtige Rolle symbiotischer Pilze hängt mit der Keimung von Orchideensamen zusammen; Alle Orchidaceae-Arten sind während der Keimung und des Keimlingsstadiums (anfängliche Mykoheterotrophie) mykoheterotroph, auch diejenigen, die in erwachsenen Stadien Photosynthese betreiben. Aufgrund des Mangels an Nahrungsreserven in Orchideensamen sind Pilzsymbionten unerlässlich, um Substrate bereitzustellen und die Keimung zu ermöglichen. Die Analyse der Keimungsstadien nach strukturellen Perspektiven kann auch wichtige Fragen zur Interaktion der Pilze mit den Samen beantworten. Verschiedene bildgebende Verfahren können angewendet werden, um Pilzendophyten in Pflanzengeweben zu enthüllen, wie in diesem Artikel vorgeschlagen. Freihändige und dünne Schnitte von Pflanzenorganen können gefärbt und anschließend lichtmikroskopisch beobachtet werden. Ein mit Weizenkeimagglutinin konjugiertes Fluorochrom kann auf die Pilze aufgetragen und mit Calcofluor White co-inkubiert werden, um Pflanzenzellwände in der konfokalen Mikroskopie hervorzuheben. Darüber hinaus werden die Methoden der Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie für mykoheterotrophe Orchideen detailliert beschrieben und die Möglichkeiten der Anwendung solcher Protokolle in verwandten Pflanzen untersucht. Die symbiotische Keimung von Orchideensamen (d.h. in Gegenwart von Mykorrhizapilzen) wird im Protokoll ausführlich beschrieben, ebenso wie Möglichkeiten, die aus verschiedenen Keimungsstadien erhaltenen Strukturen für Analysen mit Licht-, Konfokal- und Elektronenmikroskopie vorzubereiten.

Introduction

Strukturforschung in der Botanik, die Pflanzenmorphologie und Anatomie abdeckt, ist grundlegend für das Verständnis des gesamten Organismus^1,2 und bietet unverzichtbare Perspektiven, um Wissen über die Ökologie^, Physiologie, Entwicklung und Evolution von Pflanzen zu integrieren und dazu beizutragen³. Methoden in der Pflanzenmorphologie und Anatomie umfassen derzeit Protokolle, Geräte und Kenntnisse, die in jüngster Zeit sowie vor mehr als einem Jahrhundert entwickelt wurden². Die kontinuierliche Durchführung und Anpassung klassischer Methoden (z.B. Lichtmikroskopie) sowie neuerer Techniken (z.B. konfokale Mikroskopie, Röntgenmikrotomographie) haben die gleiche wesentliche Grundlage: theoretisches Wissen, das die Entwicklung einer Methodik ermöglicht.

Das Hauptwerkzeug in der Pflanzenanatomie und -morphologie ist das Bild. Trotz des Missverständnisses, dass es sich bei solchen Analysen um einfache Beobachtungen handelt, die subjektiven Interpretationen Raum geben², erfordert die Analyse und das Verständnis von Bildern in diesem Bereich Kenntnisse der angewandten Methoden (Ausrüstung, Art der Analyse, methodische Verfahren), der Zellbestandteile, der Histochemie und des Pflanzenkörpers (Gewebeorganisation und -funktion, Ontogenese, morphologische Anpassungen). Die Interpretation der mit einer Vielzahl von Methoden erhaltenen Bilder kann dazu führen, Form und Funktion zu korrelieren, die chemische Zusammensetzung einer Struktur zu entschlüsseln, die Beschreibung von Taxa zu bestätigen, Infektionen durch Phytopathogene zu verstehen und andere solche Bewertungen.

Bei der Erforschung mykoheterotropher (MH) Pflanzen (d.h. nicht-photosynthetischer Pflanzen, die Kohlenstoff aus Mykorrhizapilzen gewinnen^4,5), können bemerkenswerte Aspekte ihrer strukturellen Anpassungen, die Muster der Gewebebesiedlung durch Pilze und die Morphoanatomie unterirdischer Organe ihre Entwicklungsstrategien und Beziehungen zu Hyphen^, die die Quelle von Nährstoffen sind, aufklären. Die unterirdischen Organe von MH-Pflanzen zeigen in der Regel wichtige Anpassungen im Zusammenhang mit ihrer Assoziation mit Bodenpilzen, daher ist es wichtig, diese anatomischen und morphologischen Untersuchungen durchzuführen⁶. Die Luftorgane von MH-Arten sollten nicht ignoriert werden, da in diesen Geweben auch Endophyten vorhanden sein können, auch wenn es sich nicht um Mykorrhizapilze handelt (persönliche Beobachtungen, noch nicht veröffentlicht).

Neben der gut etablierten Wesentlichkeit der Assoziation von Mykorrhizapilzen mit MH-Arten während ihres gesamten Lebenszyklus⁷ hat jede Orchideenart, auch die autotrophen, ein initiales obligates mykoheterotrophes Stadium in natürlichen Umgebungen. Es tritt auf, weil der Embryo der Orchideen undifferenziert ist und kein Endosperm oder Keimblätter aufweist, so dass er ohne die Ernährungsunterstützung von Pilzpartnern nicht in der Lage ist, sich in natürlichen Umgebungen zu entwickeln und zu etablieren ^4,8. In Anbetracht dessen können symbiotische Keimungsprotokolle nicht nur auf MH-Arten, sondern auch auf photosynthetisierende Orchideen angewendet werden, um die Spezifität von Orchideen und Pilzen bei der Keimung und Protocormentwicklung zu untersuchen, eine weitgehend angewandte Methodik in Initiativen zur Erhaltung bedrohter Arten 9,10,11.

In dieser Methodenmontage beschreiben wir wichtige Schritte zur Entnahme, Fixierung und Lagerung von MH-Pflanzenproben für anatomische Studien (Abschnitt 1), Oberflächenanalyse und Probenauswahl (Abschnitt 2), Schnittmethoden (Freihand: Abschnitt 3, Mikrotomie: Abschnitt 4, Kryomikrotomie: Abschnitt 5), Färbung und Montage (Abschnitt 6), Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie von Pilzendophyten (Abschnitt 7), Rasterelektronenmikroskopie (Abschnitt 8), und Transmissionselektronenmikroskopie (Abschnitt 9). Darüber hinaus beschreiben wir eine symbiotische Keimungsmethode für Orchideensamen (MH und autotroph, Abschnitt 10), da die zuvor genannten bildgebenden Verfahren erfolgreich angewendet werden können, um die Pilzbesiedlung von Samen, Protocormen und Keimlingen im Keimprozess zu analysieren.

Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung bildgebender Verfahren. Die Schaltpläne geben Hinweise auf Protokollschritte, in denen sie detailliert sind. Abkürzungen: GMA = Glykolmethacrylat, OCT = optimale Schnitttemperaturverbindung, REM = Rasterelektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Den hier im Detail beschriebenen Mikroskopietechniken (Abbildung 1) gehen folgende wesentliche Schritte voraus: Sammeln, Fixieren, Dehydrieren, Einbetten und Schneiden von Proben. Da die Schritte je nach gewählter Technik(en) unterschiedlich sind (Abbildung 1), ist es wichtig, vorausschauend zu denken und zu berücksichtigen, welche Fixiermittel vorbereitet und zur Sammelstelle transportiert werden sollen, wie die Proben vor der Fixierung vorbereitet werden müssen, welche Dehydratisierungsverfahren anzuwenden sind (Abschnitt 1) und welche Möglichkeiten und Schnittmethoden es gibt (Abschnitte 4, 5, und 9). Abbildung 1 fasst nacheinander alle Schritte zusammen, die für jede unten beschriebene Mikroskopietechnik erforderlich sind.

Protocol

1. Sammeln, Reparieren und Pflegen von Mustern ANMERKUNG: Voll-MH-Pflanzen können normalerweise im dunklen Waldunterholz 12,13 gefunden werden, hauptsächlich in feuchten und streureichen Gebieten, während MH-Pflanzen teilweise in offeneren Wäldern 12,13 gefunden werden können. MH-Pflanzen haben in der Regel gut entwickelte unterirdische Organe in einer Vielz…

Representative Results

Nach den wesentlichen Stadien der Fixierung von Pflanzengewebe ergeben Zellstrukturen, die dem Lebenszustand unter Berücksichtigung der Morphologie, des Volumens und der räumlichen Organisation von Zellkomponenten und Geweben so ähnlich wie möglich sind16. Beobachten Sie solche Merkmale in den Proben nach der chemischen Fixierung (Abbildung 4). Abbildung 4C-F stellt ausreichend fixierte Proben unter L…

Discussion

Bildanalysen in der Pflanzenanatomie und -morphologie haben ein wichtiges Potenzial, Ziele zu erreichen und zum Verständnis der Beziehungen zwischen mykoheterotrophen Pflanzen und ihren unverzichtbaren Pilzendophyten beizutragen, wie Untersuchungen unterirdischer Organe^6,40, Strukturanalysen der symbiotischen Keimung von Samen³⁹ sowie Luft- und Fortpflanzungsstrukturen ⁴¹ zeigen. . Obwohl die strukturelle Botanik i…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation – OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation – OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation – OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)