Tecniche di microscopia per l'interpretazione della colonizzazione fungina nei tessuti delle piante micoeterotrofiche e della germinazione simbiotica dei semi

Summary

Questo protocollo mira a fornire procedure dettagliate per la raccolta, la fissazione e il mantenimento di campioni di piante micoeterotrofiche, applicando diverse tecniche di microscopia come la microscopia elettronica a scansione e trasmissione, la microscopia ottica, confocale e a fluorescenza per studiare la colonizzazione fungina nei tessuti delle piante e nei semi germinati con funghi micorrizici.

Abstract

La botanica strutturale è una prospettiva indispensabile per comprendere appieno l’ecologia, la fisiologia, lo sviluppo e l’evoluzione delle piante. Quando si studiano piante micoeterotrofiche (cioè piante che ottengono carbonio dai funghi), aspetti notevoli dei loro adattamenti strutturali, i modelli di colonizzazione dei tessuti da parte dei funghi e la morfoanatomia degli organi sotterranei possono illuminare le loro strategie di sviluppo e le loro relazioni con le ife, la fonte di nutrienti. Un altro ruolo importante dei funghi simbionti è legato alla germinazione dei semi di orchidea; tutte le specie di Orchidaceae sono micoeterotrofiche durante la germinazione e la fase di semina (micoeterotrofia iniziale), anche quelle che fotosintetizzano negli stadi adulti. A causa della mancanza di riserve nutrizionali nei semi di orchidee, i simbionti fungini sono essenziali per fornire substrati e consentire la germinazione. L’analisi delle fasi di germinazione da prospettive strutturali può anche rispondere a domande importanti riguardanti l’interazione dei funghi con i semi. Diverse tecniche di imaging possono essere applicate per svelare gli endofiti dei funghi nei tessuti vegetali, come proposto in questo articolo. Le sezioni a mano libera e sottili degli organi vegetali possono essere colorate e quindi osservate con microscopia ottica. Un fluorocromo coniugato all’agglutinina del germe di grano può essere applicato ai funghi e co-incubato con Calcofluor White per evidenziare le pareti cellulari delle piante in microscopia confocale. Inoltre, le metodologie di scansione e microscopia elettronica a trasmissione sono dettagliate per orchidee micoeterotrofe e vengono esplorate le possibilità di applicare tali protocolli in piante correlate. La germinazione simbiotica dei semi di orchidea (cioè in presenza di funghi micorrizici) è descritta nel protocollo in dettaglio, insieme alle possibilità di preparare le strutture ottenute da diversi stadi di germinazione per analisi con microscopia ottica, confocale ed elettronica.

Introduction

La ricerca strutturale in botanica, che copre la morfologia e l’anatomia delle piante, è fondamentale per comprendere l’intero organismo^1,2 e fornisce prospettive indispensabili per integrare e contribuire alla conoscenza riguardante l’ecologia, la fisiologia^, lo sviluppo e l’evoluzione delle piante³. I metodi in morfologia e anatomia vegetale comprendono attualmente protocolli, attrezzature e conoscenze sviluppate di recente e più di un secolo fa². L’esecuzione e l’adattamento continui di metodi classici (ad esempio, microscopia ottica) insieme a tecniche più recenti (ad esempio, microscopia confocale, microtomografia a raggi X) hanno la stessa base essenziale: conoscenze teoriche che consentono lo sviluppo di una metodologia.

Lo strumento principale nell’anatomia e nella morfologia delle piante è l’immagine. Nonostante l’idea errata che tali analisi siano semplici osservazioni, dando spazio a interpretazioni soggettive², l’analisi e la comprensione delle immagini in quest’area richiede la conoscenza dei metodi applicati (l’attrezzatura, il tipo di analisi, le procedure metodologiche), i componenti cellulari, l’istochimica e il corpo vegetale (organizzazione e funzione dei tessuti, ontogenesi, adattamenti morfologici). L’interpretazione delle immagini ottenute attraverso una varietà di metodi può portare a correlare forma e funzione, decifrare la composizione chimica di una struttura, corroborare nella descrizione dei taxa, comprendere le infezioni da fitopatogeni e altre valutazioni simili.

Quando si studiano piante micoeterotrofe (MH) (cioè piante non fotosintetiche che ottengono carbonio dai funghi micorrizici^4,5), aspetti notevoli dei loro adattamenti strutturali, i modelli di colonizzazione dei tessuti da parte dei funghi e la morfoanatomia degli organi sotterranei possono illuminare le loro strategie di sviluppo e le relazioni con le ife^, che sono la fonte di nutrienti. Gli organi sotterranei delle piante MH di solito mostrano importanti adattamenti legati alla loro associazione con i funghi del suolo, quindi è essenziale eseguire queste indagini anatomiche e morfologiche⁶. Gli organi aerei delle specie MH non devono essere ignorati, poiché gli endofiti possono essere presenti anche in questi tessuti, anche se non sono funghi micorrizici (osservazioni personali, non ancora pubblicate).

Oltre alla consolidata essenzialità dell’associazione dei funghi micorrizici con le specie MH durante il loro intero ciclo vitale⁷, ogni specie di orchidea, anche quelle autotrofe, ha un primo stadio micoeterotrofico obbligato in ambienti naturali. Si verifica perché l’embrione delle orchidee è indifferenziato e manca di un endosperma o di cotiledoni, essendo quindi incapace di svilupparsi e stabilirsi in ambienti naturali senza il supporto nutrizionale di partner fungini ^4,8. Considerando che, i protocolli di germinazione simbiotica possono essere applicati non solo alle specie MH ma anche alle orchidee fotosintetizzanti, con l’obiettivo di indagare la specificità orchidea-fungo nella germinazione e nello sviluppo del protocormo, una metodologia ampiamente applicata nelle iniziative per la conservazione delle specie minacciate 9,10,11.

In questo assemblaggio di metodi, descriviamo importanti passaggi coinvolti nella raccolta, fissazione e conservazione di campioni di piante MH per studi anatomici (sezione 1), analisi superficiale e selezione dei campioni (sezione 2), metodi di sezionamento (mano libera: sezione 3, microtomia: sezione 4, criomicrotomia: sezione 5), colorazione e montaggio (sezione 6), fluorescenza e microscopia confocale di endofiti fungini (sezione 7), microscopia elettronica a scansione (sezione 8), e microscopia elettronica a trasmissione (sezione 9). Inoltre, descriviamo un metodo di germinazione simbiotica per i semi di orchidea (MH e autotrofico, sezione 10), poiché i metodi di imaging precedentemente menzionati possono essere applicati con successo per analizzare la colonizzazione fungina di semi, protocormi e piantine nel processo di germinazione.

Figura 1: Riepilogo schematico dei metodi di imaging. Gli schemi forniscono indicazioni sui passaggi del protocollo in cui sono dettagliati. Abbreviazioni: GMA = glicole metacrilato, OCT = composto con temperatura di taglio ottimale, SEM = microscopia elettronica a scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Le tecniche di microscopia qui descritte in dettaglio (Figura 1) sono precedute dalle seguenti fasi essenziali: raccolta, fissaggio, disidratazione, incorporamento e sezionamento dei campioni. Poiché le fasi sono variabili (Figura 1) a seconda della tecnica o delle tecniche scelte, è importante pensare in anticipo, considerando i fissativi da preparare e trasportare al sito di raccolta, come i campioni devono essere preparati prima del fissaggio, i processi di disidratazione da utilizzare (sezione 1) e le diverse possibilità di incorporamento e metodi di sezionamento (sezioni 4, 5, e 9). La Figura 1 riassume sequenzialmente tutti i passaggi necessari per ciascuna tecnica di microscopia descritti dettagliatamente di seguito.

Protocol

1. Raccolta, fissaggio e conservazione dei campioni NOTA: Le piante completamente MH si trovano di solito nel sottobosco della foresta oscura 12,13, principalmente in aree umide e abbondanti di rifiuti, mentre le piante parzialmente MH possono essere trovate nelle foreste più aperte12,13. Le piante MH di solito hanno organi sotterranei ben sviluppati in una vari…

Representative Results

Seguendo le fasi essenziali di fissaggio del tessuto vegetale si ottengono strutture cellulari il più possibile simili allo stato vivente, considerando la morfologia, il volume e l’organizzazione spaziale dei componenti cellulari e dei tessuti16. Osservare tali tratti nei campioni dopo la fissazione chimica (Figura 4). La figura 4C-F rappresenta campioni adeguatamente fissati al microscopio ottico. Segui…

Discussion

Le analisi delle immagini nell’anatomia e morfologia delle piante hanno un importante potenziale per raggiungere gli obiettivi e aiutare a comprendere le relazioni tra le piante micoeterotrofe e i loro indispensabili endofiti fungini, come dimostrato dagli studi sugli organi sotterranei^6,40, dalle analisi strutturali della germinazione simbiotica dei semi³⁹ e dalle strutture aeree e riproduttive ⁴¹ . La botanica str…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation – OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation – OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation – OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)