Mikroskopi teknikker for tolkning av soppkolonisering i mykoheterotrofe plantevev og symbiotisk spiring av frø

Summary

Denne protokollen tar sikte på å gi detaljerte prosedyrer for innsamling, fiksering og vedlikehold av mykoheterotrofe planteprøver, ved å bruke forskjellige mikroskopiteknikker som skanning og transmisjonselektronmikroskopi, lys, konfokal og fluorescensmikroskopi for å studere soppkolonisering i plantevev og frø spiret med mykorrhizal sopp.

Abstract

Strukturell botanikk er et uunnværlig perspektiv for å forstå økologi, fysiologi, utvikling og evolusjon av planter fullt ut. Når man forsker på mykoheterotrofe planter (dvs. planter som får karbon fra sopp), kan bemerkelsesverdige aspekter av deres strukturelle tilpasninger, mønstrene for vevkolonisering av sopp og morfoanatomien til underjordiske organer opplyse deres utviklingsstrategier og deres forhold til hyfer, kilden til næringsstoffer. En annen viktig rolle for symbiotiske sopp er relatert til spiring av orkidéfrø; alle Orchidaceae-arter er mykoheterotrofe under spiring og frøplantestadium (innledende mykoheterotrofi), selv de som fotosyntetiserer i voksne stadier. På grunn av mangel på næringsreserver i orkidéfrø, er soppsymbionter avgjørende for å gi substrater og muliggjøre spiring. Å analysere spiringsstadier ved strukturelle perspektiver kan også svare på viktige spørsmål angående soppens interaksjon med frøene. Ulike bildebehandlingsteknikker kan brukes til å avdekke soppendofytter i plantevev, som foreslått i denne artikkelen. Frihånd og tynne deler av planteorganer kan farges og deretter observeres ved hjelp av lysmikroskopi. En fluorokrom konjugert til hvetekimagglutinin kan påføres sopp og inkuberes med Calcofluor White for å markere plantecellevegger i konfokalmikroskopi. I tillegg er metodene for skanning og transmisjonselektronmikroskopi detaljert for mykoheterotrofe orkideer, og mulighetene for å anvende slike protokoller i relaterte planter blir utforsket. Symbiotisk spiring av orkidéfrø (dvs. i nærvær av mykorrhizal sopp) er beskrevet i protokollen i detalj, sammen med muligheter for å forberede strukturer oppnådd fra forskjellige stadier av spiring for analyser med lys, konfokal og elektronmikroskopi.

Introduction

Strukturforskning i botanikk, som dekker plantemorfologi og anatomi, er grunnleggende for å forstå hele organismen^1,2, og gir uunnværlige perspektiver for å integrere og bidra til kunnskap om økologi, fysiologi^, utvikling og evolusjon av planter³. Metoder i plantemorfologi og anatomi omfatter i dag protokoller, utstyr og kunnskap utviklet nylig så vel som for mer enn et århundre siden². Den kontinuerlige utførelsen og tilpasningen av klassiske metoder (f.eks. Lysmikroskopi) sammen med nyere teknikker (f.eks. Konfokalmikroskopi, røntgenmikrotomografi) har samme viktige grunnlag: teoretisk kunnskap som muliggjør utvikling av en metodikk.

Hovedverktøyet i planteanatomi og morfologi er bildet. Til tross for misforståelsen om at slike analyser er enkle observasjoner, gir plass til subjektive tolkninger², krever analyse og forståelse av bilder på dette området kunnskap om metodene som brukes (utstyret, type analyse, metodologiske prosedyrer), cellekomponenter, histokjemi og plantekroppen (vevsorganisasjon og funksjon, ontogeni, morfologiske tilpasninger). Tolkning av bildene oppnådd ved hjelp av en rekke metoder kan føre til korrelerende form og funksjon, dechiffrere den kjemiske sammensetningen av en struktur, bekrefte i å beskrive taxa, forstå infeksjoner av fytopatogener og andre slike vurderinger.

Når man forsker på mykoheterotrofe (MH) planter (dvs. ikke-fotosyntetiske planter som får karbon fra mykorrhizal sopp^4,5), kan bemerkelsesverdige aspekter av deres strukturelle tilpasninger, mønstrene for vevkolonisering av sopp og morfoanatomi av underjordiske organer opplyse deres utviklingsstrategier og forhold til hyfer^, som er kilden til næringsstoffer. De underjordiske organene til MH-planter viser vanligvis viktige tilpasninger knyttet til deres tilknytning til jordsvamp, derfor er det viktig å utføre disse anatomiske og morfologiske undersøkelsene⁶. MH-arters luftorganer bør ikke ignoreres, da endofytter også kan være tilstede i disse vevene, selv om de ikke er mykorrhizale sopp (personlige observasjoner, ikke publisert ennå).

I tillegg til den veletablerte essensen av mykorrhizal soppforening med MH-arter i løpet av hele livssyklusen⁷, har hver orkidéart, selv de autotrofe, et innledende obligatorisk mykoheterotrofisk stadium i naturlige miljøer. Det oppstår fordi orkideenes embryo er utifferentiert og mangler endosperm eller cotyledoner, og dermed ikke er i stand til å utvikle og etablere seg i naturlige miljøer uten næringsstøtte fra sopppartnere ^4,8. Tatt i betraktning at symbiotiske spiringsprotokoller kan brukes ikke bare på MH-arter, men også på fotosyntetiserende orkideer, med sikte på å undersøke orkidé-soppspesifisitet i spiring og protocormutvikling, en enormt anvendt metodikk i initiativer for bevaring av truede arter 9,10,11.

I denne metodesamlingen beskriver vi viktige trinn involvert i innsamling, fiksering og lagring av MH-planteprøver for anatomiske studier (seksjon 1), overflateanalyse og prøvevalg (seksjon 2), seksjoneringsmetoder (frihånd: seksjon 3, mikrotomi: seksjon 4, kryomikrotomi: seksjon 5), farging og montering (seksjon 6), fluorescens og konfokal mikroskopi av soppendofytter (seksjon 7), skanning elektronmikroskopi (seksjon 8), og transmisjonselektronmikroskopi (pkt. 9). I tillegg beskriver vi en symbiotisk spiringsmetode for orkidéfrø (MH og autotrofisk, seksjon 10), da de tidligere nevnte avbildningsmetodene med hell kan brukes til å analysere soppkolonisering av frø, protokormer og frøplanter i spiringsprosessen.

Figur 1: Skjematisk oppsummering av bildemetoder. Skjemaene gir indikasjoner på protokolltrinn der de er detaljerte. Forkortelser: GMA = glykolmetakrylat, OCT = optimal skjæretemperaturforbindelse, SEM = skanningelektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mikroskopiteknikkene beskrevet her i detalj (figur 1) innledes av følgende viktige trinn: innsamling, festing, dehydrering, innebygging og seksjonering av prøver. Siden trinnene er variable (figur 1) avhengig av valgt(e) teknikk(er), er det viktig å tenke fremover, med tanke på fikseringsmidlene som skal klargjøres og transporteres til innsamlingsstedet, hvordan prøvene må klargjøres før fiksering, dehydreringsprosessene som skal brukes (avsnitt 1), og ulike innbyggingsmuligheter og snittingsmetoder (§§ 4, 5, og 9). Figur 1 oppsummerer sekvensielt alle trinnene som kreves for hver mikroskopiteknikk grundig beskrevet nedenfor.

Protocol

1. Innsamling, fiksering og vedlikehold av prøver MERK: Fullt MH-planter kan vanligvis finnes i den mørke skogen under 12,13, hovedsakelig i fuktige og søppelrike områder, mens delvis MH-planter finnes i mer åpne skoger 12,13. MH-planter har vanligvis velutviklede underjordiske organer i en rekke former og størrelser. Når du samler MH-arter, ut…

Representative Results

Etter de essensielle stadiene av å fikse plantevev gir cellulære strukturer så lik levende tilstand som mulig, med tanke på morfologi, volum og romlig organisering av cellulære komponenter og vev16. Observer slike egenskaper i prøvene etter kjemisk fiksering (figur 4). Figur 4C-F representerer tilstrekkelig faste prøver under lysmikroskopi. Å følge fikseringsprosedyrene som er beskrevet og skaffe…

Discussion

Bildeanalyser i planteanatomi og morfologi har et viktig potensial for å oppfylle mål og bidra til å forstå forholdet mellom mykoheterotrofe planter og deres uunnværlige soppendofytter, som demonstrert ved studier av underjordiske organer 6,40, strukturelle analyser av symbiotisk spiring av frø^39, og luft- og reproduktive strukturer ⁴¹ . Strukturell botanikk, til tross for å ha mistet sin prestisje og plass t…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation – OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation – OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation – OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)