Mikroskopitekniker för tolkning av svampkolonisering i mykoheterotrofa växtvävnader och symbiotisk spiring av frön

Summary

Detta protokoll syftar till att tillhandahålla detaljerade procedurer för insamling, fixering och underhåll av mykoheterotrofa växtprover, med tillämpning av olika mikroskopitekniker som skannings- och överföringselektronmikroskopi, ljus-, konfokal- och fluorescensmikroskopi för att studera svampkolonisering i växtvävnader och frön groddar med mykorrhizasvampar.

Abstract

Strukturell botanik är ett oumbärligt perspektiv för att fullt ut förstå växternas ekologi, fysiologi, utveckling och utveckling. När man undersöker mykoheterotrofa växter (dvs växter som får kol från svampar) kan anmärkningsvärda aspekter av deras strukturella anpassningar, mönstren för vävnadskolonisering av svampar och morfoanatomin hos underjordiska organ upplysa deras utvecklingsstrategier och deras relationer med hyfer, källan till näringsämnen. En annan viktig roll av symbiotiska svampar är relaterad till spiring av orkidéfrön; alla Orchidaceae-arter är mykoheterotrofa under groning och plantor (initial mykoheterotrofi), även de som fotosyntetiserar i vuxna stadier. På grund av bristen på näringsreserver i orkidéfrön är svampsymbionter viktiga för att ge substrat och möjliggöra spiring. Att analysera grobarhetsstadier med strukturella perspektiv kan också svara på viktiga frågor om svamparnas interaktion med fröna. Olika avbildningstekniker kan tillämpas för att avslöja svampendofyter i växtvävnader, som föreslås i denna artikel. Frihand och tunna delar av växtorgan kan färgas och sedan observeras med hjälp av ljusmikroskopi. En fluorokrom konjugerad till vetegroddar agglutinin kan appliceras på svamparna och inkuberas tillsammans med Calcofluor White för att markera växtcellväggar i konfokalmikroskopi. Dessutom beskrivs metoderna för skanning och överföringselektronmikroskopi för mykoheterotrofa orkidéer, och möjligheterna att tillämpa sådana protokoll i besläktade växter undersöks. Symbiotisk spiring av orkidéfrön (dvs i närvaro av mykorrhizasvampar) beskrivs i protokollet i detalj, tillsammans med möjligheter att förbereda strukturerna erhållna från olika stadier av spiring för analyser med ljus-, konfokal- och elektronmikroskopi.

Introduction

Strukturforskning inom botanik, som omfattar växtmorfologi och anatomi, är grundläggande för att förstå hela organismen^1,2 och ger oumbärliga perspektiv för att integrera och bidra till kunskap om växters ekologi, fysiologi^, utveckling och utveckling³. Metoder inom växtmorfologi och anatomi omfattar för närvarande protokoll, utrustning och kunskap som utvecklats nyligen såväl som för mer än ett sekel sedan². Det kontinuerliga utförandet och anpassningen av klassiska metoder (t.ex. ljusmikroskopi) tillsammans med nyare tekniker (t.ex. konfokalmikroskopi, röntgenmikrotomografi) har samma väsentliga grund: teoretisk kunskap som möjliggör utveckling av en metod.

Huvudverktyget i växtanatomi och morfologi är bilden. Trots missuppfattningen att sådana analyser är enkla observationer, vilket ger utrymme för subjektiva tolkningar², kräver analys och förståelse av bilder inom detta område kunskap om de metoder som tillämpas (utrustning, typ av analys, metodologiska förfaranden), cellkomponenter, histokemi och växtkroppen (vävnadsorganisation och funktion, ontogeni, morfologiska anpassningar). Tolkning av de bilder som erhållits via en mängd olika metoder kan leda till korrelerande form och funktion, dechiffrera den kemiska sammansättningen av en struktur, bekräfta i beskrivningen av taxa, förstå infektioner av fytopatogener och andra sådana bedömningar.

När man undersöker mykoheterotrofa (MH) växter (dvs. icke-fotosyntetiska växter som erhåller kol från mykorrhizasvampar^4,5), kan anmärkningsvärda aspekter av deras strukturella anpassningar, mönstren för vävnadskolonisering av svampar och morfoanatomin hos underjordiska organ upplysa deras utvecklingsstrategier och relationer med hyfer^, som är källan till näringsämnen. De underjordiska organen hos MH-växter visar vanligtvis viktiga anpassningar relaterade till deras förening med marksvampar, därför är det viktigt att utföra dessa anatomiska och morfologiska undersökningar⁶. MH-arters luftorgan bör inte ignoreras, eftersom endofyter också kan finnas i dessa vävnader, även om de inte är mykorrhizasvampar (personliga observationer, inte publicerade ännu).

Förutom den väletablerade väsentligheten hos mykorrhizasvampar som associeras med MH-arter under hela deras livscykel⁷, har varje orkidéart, även de autotrofa, ett initialt obligatoriskt mykoheterotrofiskt stadium i naturliga miljöer. Det uppstår eftersom orkidéernas embryo är odifferentierat och saknar endosperm eller kotyledoner, vilket är oförmöget att utveckla och etablera sig i naturliga miljöer utan näringsstöd från svamppartners ^4,8. Med tanke på detta kan symbiotiska grobarhetsprotokoll tillämpas inte bara på MH-arter utan också på fotosyntetiserande orkidéer, som syftar till att undersöka orkidé-svampspecificitet vid grobarhet och protocormutveckling, en mycket tillämpad metod i initiativ för bevarande av hotade arter 9,10,11.

I denna metodsammansättning beskriver vi viktiga steg som är involverade i insamling, fixering och lagring av MH-växtprover för anatomiska studier (avsnitt 1), ytanalys och provval (avsnitt 2), sektionsmetoder (frihand: avsnitt 3, mikrotomi: avsnitt 4, kryomikrotomi: avsnitt 5), färgning och montering (avsnitt 6), fluorescens och konfokalmikroskopi av svampendofyter (avsnitt 7), svepelektronmikroskopi (avsnitt 8), och transmissionselektronmikroskopi (avsnitt 9). Dessutom beskriver vi en symbiotisk grobarhetsmetod för orkidéfrön (MH och autotrofisk, avsnitt 10), eftersom de tidigare nämnda avbildningsmetoderna framgångsrikt kan tillämpas för att analysera svampkolonisering av frön, protokormer och plantor i groningsprocessen.

Figur 1: Schematisk sammanfattning av avbildningsmetoder. Scheman ger indikationer på protokollsteg där de är detaljerade. Förkortningar: GMA = glykolmetakrylat, OCT = optimal skärtemperaturförening, SEM = svepelektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De mikroskopitekniker som beskrivs här i detalj (figur 1) föregås av följande viktiga steg: insamling, fixering, uttorkning, inbäddning och sektionering av prover. Eftersom stegen är variabla (figur 1) beroende på den eller de valda teknikerna är det viktigt att tänka framåt, med tanke på de fixeringsmedel som ska beredas och transporteras till uppsamlingsplatsen, hur proverna måste beredas innan de fixeras, de uttorkningsprocesser som ska användas (avsnitt 1) och olika inbäddningsmöjligheter och sektioneringsmetoder (avsnitt 4, 5). och 9). Figur 1 sammanfattar sekventiellt alla steg som krävs för varje mikroskopiteknik som beskrivs noggrant nedan.

Protocol

1. Insamling, fixering och underhåll av prover OBS: Helt MH-växter kan vanligtvis hittas i den mörka skogen understory 12,13, främst i fuktiga och kullrika områden, medan delvis MH-växter finns i mer öppna skogar12,13. MH-växter har vanligtvis välutvecklade underjordiska organ i olika former och storlekar. När du samlar MH-arter, utforska jo…

Representative Results

Efter de väsentliga stadierna för fixering av växtvävnad ger cellulära strukturer så lika som möjligt till levande tillstånd, med tanke på morfologi, volym och rumslig organisation av cellulära komponenter och vävnader16. Observera sådana egenskaper i proverna efter kemisk fixering (figur 4). Figur 4C-F representerar tillräckligt fixerade prover under ljusmikroskopi. Att följa de beskrivna f…

Discussion

Bildanalyser inom växtanatomi och morfologi har en viktig potential att uppfylla mål och hjälpa till att förstå sambanden mellan mykoheterotrofa växter och deras oumbärliga svampendofyter, vilket framgår av studier av underjordiska organ^6,40, strukturella analyser av symbiotisk spiring av frön³⁹ och luft- och reproduktionsstrukturer ⁴¹ . Strukturell botanik, trots att den har förlorat sin prestige och sitt…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation – OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation – OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation – OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)