本协议描述了在使用液相色谱-串联质谱分析之前通过三氯乙酸(TCA)蛋白质沉淀和酸水解 从 生物基质中提取非蛋白质氨基酸。
非蛋白质氨基酸 (NPAA) 是一大类氨基酸 (AA),它们未通过基因编码以翻译成蛋白质。NPAA的分析可以提供有关细胞摄取和/或功能,代谢途径和潜在毒性的关键信息。β-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)是由各种藻类产生的神经毒性NPAA,与神经退行性疾病的风险增加有关,这导致了重大的研究兴趣。提取AA进行分析的方法有很多,其中液相色谱-串联质谱是最常见的,需要蛋白质沉淀,然后酸水解蛋白质沉淀。关于藻类中BMAA存在的研究提供了相互矛盾的结果,使用未经验证的样品制备/提取和分析是主要原因。与大多数NPAA一样,蛋白质沉淀在10%的TCA水溶液中并用发烟的HCl水解是BMAA及其异构体氨乙基甘氨酸(AEG)和2,4-二氨基丁酸(2,4-DAB)的最合适提取形式。本协议描述了研究和教学实验室中常用的经过验证的NPAA提取方法中的步骤。
氨基酸是含有至少一个胺和羧酸官能团的化合物。一些氨基酸还含有亚氨基,羧酸以外的功能酸基团;其他氨基酸具有不与α-碳基团1相连的胺基。有超过500种氨基酸2,其中22种被称为蛋白质氨基酸,用于核糖体蛋白质合成中的遗传编码3。这22种氨基酸可以进一步细分为必需氨基酸和非必需氨基酸。必需氨基酸是生物体正常运作所必需的,只能通过外部来源获得。非必需氨基酸可以在生物体内合成。将22种氨基酸分为必需/非必需氨基酸是个别物种独有的。所有其他氨基酸都是非蛋白质氨基酸(NPAA),不编码用于蛋白质合成。氨基酸,无论是蛋白质还是非蛋白质,也可以在生物体内发挥信号传导作用,并充当代谢中介4。由于其重要且不同的作用,氨基酸水平可以提供对生物状况、功能和代谢途径等的洞察。氨基酸可以掺入多肽链中有两种主要机制:核糖体蛋白质合成,它利用编码中的22个氨基酸,以及非核糖体肽合成,它与蛋白质氨基酸一起,允许在合成中使用一些NPAA。某些NPAA可以模仿蛋白质氨基酸,可能导致它们误入肽和蛋白质中。错误掺入会导致蛋白质的错误折叠,这反过来又会产生有害影响5,例如错误掺入NPAA L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)代替酪氨酸,对细胞功能和健康产生负面影响6,7。掺入NPAA的另一个来源是通过氨基酸残基的翻译后修饰(PTM)。氨基酸残基因各种原因被修饰,包括肽或蛋白质构象、稳定性和功能的变化。在含PTM的蛋白质或肽水解后,这些修饰的氨基酸残基被释放成其游离NPAA形式8,9。
由蓝藻、硅藻和甲藻10 产生的 NPAA β-甲基氨基-L-丙氨酸 (BMAA) 是一种疑似神经毒素,与各种神经退行性疾病有关,例如肌萎缩侧索硬化症/帕金森综合征-痴呆复合体 (ALS-PDC)11,12、肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默病13.有人建议将BMAA错误地掺入蛋白质多肽链中,以代替L-丝氨酸14 和/或其他蛋白质氨基酸。BMAA的错误掺入可导致蛋白质的错误折叠,导致蛋白质聚集体在神经元中的沉积14。在过去十年中,对BMAA的兴趣显着增加。已经发现来自淡水,海洋和咸水环境的各种蓝藻物种产生BMAA15,导致它们广泛分布到各种生态系统中16,17。此外,BMAA已被证明可以通过食物链生物放大到人类食物网18,19。由于BMAA毒性的潜在健康影响,缺乏理解和不一致,必须继续进一步研究,直到最终了解BMAA的毒性或BMAA被认为是安全的20,21。
生物样品中氨基酸的分析可分为四个主要步骤:样品制备、氨基酸衍生化、分离和检测以及鉴定和定量。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)是首选的分析方法,因为它提供了靶向且可重现的氨基酸分离和分析。
用于分析蓝藻和其他藻类样品的样品制备技术主要涉及游离和蛋白质结合形式的氨基酸的提取方法。多年来,提取方法与常见元素保持相对一致,包括样品的去溶剂化以将游离氨基酸与其结合形式分离,然后进行蛋白质沉淀和通过在高温下用盐酸(HCl)水解释放结合的氨基酸22.这种提取形式已针对蛋白质氨基酸进行了优化,并用于NPAA。然而,在同一种类的蓝藻中对BMAA及其异构体(图1),氨基乙基甘氨酸(AEG)和2,4-二氨基丁酸(2,4-DAB)的检测和定量在文献中显示出不一致的结果,可能的解释在于生长条件和/或产生不同量或没有数量BMAA的藻类菌株的差异23.有人认为,BMAA及其异构体的检测和定量不一致的更可能的解释是由于未经验证的实验方案,使用广泛的分析技术以及报告的方法中实验细节不足16,24 导致实验室间数据不可重复。然而,Glover等人25 和Banack26 最近开发并验证了一种分析技术,用于根据国际分析化学家协会(AOAC),美国药典和FDA单实验室验证所需的指南,使用超高效液相色谱(UPLC)-MS / MS检测和定量BMAA及其异构体。
这些验证实验侧重于BMAA及其异构体的分离和检测,并未解决样品制备方案中的不一致问题。Lage等人27 比较了通过LC-MS/MS 定量 蓝藻样品中BMAA及其异构体的三种常用提取方法的性能:游离氨基酸28,29的固相萃取(SPE);一种涉及甲醇萃取和丙酮沉淀的蛋白质沉淀法30;以及最常用的BMAA提取方法,用三氯乙酸(TCA)进行蛋白质沉淀31。他们得出结论,TCA蛋白沉淀是最佳方案,与其他提取方法相比,测试样品中的BMAA浓度更高。他们的研究验证了在蓝藻基质中使用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生化BMAA的TCA提取,为实现可靠和可重现的BMAA数据提供了既定的指南。TCA氨基酸提取是一种公认的常用样品制备技术,也可以应用于其他基质。然而,需要考虑氨基酸在水解过程中的稳定性以防止降解或氧化,这可以通过使用化学改性剂和还原剂32来克服。TCA提取是常规使用并教授给新的研究生的,尽管该方案被广泛报道,但应用该方法的视觉辅助是一种宝贵的资源,可确保正确和一致的执行。
反相色谱通常用于分离氨基酸,在分析之前需要进行衍生化步骤。氨基酸(如BMAA)的衍生化允许色谱保留,并可以提高异构体之间的分离度。它还增加了分子质量并改善了质谱仪中的电离。几种衍生化试剂已用于通过LC-MS/MS分析氨基酸,包括氯甲酸丙酯(PCF)33、6-氨基喹啉基-N-氢合琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)27、9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)34和丹磺酰氯(DC)35。然而,唯一经过验证的分析BMAA技术使用PCF 36或AQC24,26,37作为衍生试剂。
该协议的范围集中在从蓝藻基质中TCA提取NPAA。这是一种劳动密集型方法,在学术和行业研究实验室中经常使用和教授,这些手稿可能缺乏细节;因此,该协议提供了制备样品以分析游离和结合的BMAA作为模型氨基酸所涉及的程序和技术的详细信息。
此处概述的用于分析NPAA的提取方案适用于分析生物样品中的任何氨基酸。有关分离和培养蓝藻菌株的指南,可以参考Violi等人38在研究中提出的方法。协议的第一步将样品带到一个点,可以实现样品之间相对于干重的归一化。第二步是细胞裂解以释放分析物,可以使用一系列技术进行,包括机械破碎/裂解,例如本协议中所述的探针超声处理,冷冻/解冻循环,研磨和珠磨,以及非机械破碎,例如酶,洗涤剂和/或化学裂解。众所周知,机械破碎优于非机械破碎,因为它允许样品具有更大的裂解能力,同时允许细胞内键和蛋白质保持完整41,尽管样品基质可能决定细胞裂解的最佳方法。
提取氨基酸进行分析时,蛋白质沉淀是该协议的关键第三步。TCA是最常用的溶剂;然而,还使用了高氯酸、丙酮、甲基叔丁基醚 (MTBE)、甲醇和/或乙腈8,42,其中每种萃取溶剂用于萃取和沉淀不同的底物。这里描述的模型从蓝藻基质中提取NPAA BMAA及其异构体,尽管已经使用了一系列不同的溶剂,但最常见的两种是水(水溶液)中的10%TCA和丙酮中的10%TCA。通常,使用TCA进行蛋白质沉淀通常用于提取氨基酸,以从蛋白质结合的氨基酸中分离出游离氨基酸。此外,TCA提取可以确定总蛋白质含量,减少游离级分的污染物,并以最小的蛋白质降解降低蛋白酶的活性43。游离级分的TCA提取的工作原理是首先冲洗掉有机可溶性物质,在沉淀物中留下蛋白质和不溶性化合物,例如细胞壁残留物,然后使用强酸热水解提取蛋白质结合的氨基酸(结合级分)。
与其他有机溶剂44 相比,用10%的TCA水溶液加超声分馏游离级分会产生最广泛的蛋白质沉淀和最佳的氨基酸回收率42。一些研究选择使用酸与有机溶剂(即丙酮43中的10%-20%TCA)结合来沉淀更多的分子,包括较小的肽/生物分子,最大限度地减少蛋白质降解,并减少盐等污染物43。丙酮中10%TCA的另一个优点是其在制备水解沉淀时干燥速度更快,最大限度地减少水分残留以防止氨基酸改性。然而,与单独使用丙酮44 中的10%TCA相比,10%水溶液TCA加超声处理对游离氨基酸的提取效率更高。此外,10%的TCA水沉淀具有局限性,例如干燥时间长,不能沉淀所有蛋白质或小肽/生物分子,并且取决于目标分析物(即蛋白质或氨基酸),需要添加剂和还原剂来防止氧化和降解45,46。
该方案使用10%水性TCA和10%TCA在丙酮中的组合来增加蛋白质沉淀,确保沉淀较小的肽/生物分子,允许更快的颗粒干燥时间,并提高提取效率,利用这两种溶剂萃取特性。然而,10%TCA水溶液和10%TCA丙酮溶液的组合可以在丙酮上清液中的10%TCA与游离水级分结合后,在游离级分中沉淀小肽/生物分子。在这种情况下,沉淀物应转移到结合的馏分中进行水解。
该协议的后半部分涉及在无氧环境中通过酸蒸气水解在高温下 从 蛋白质沉淀中释放氨基酸(即BMAA)。水解步骤的主要限制因素是制备起来既费时又费力。过夜孵育妨碍了快速、省时的样品制备和分析。此外,将颗粒从离心管定量转移到壳瓶(步骤3.4)是一个艰巨的过程,需要勤奋和耐心,以确保干重的准确归一化点。用户可能面临的问题是沉淀转移不完全、湿沉淀蛋白粘附在移液器吸头和原始管上,以及沉淀的固体颗粒阻塞移液器吸头。帮助更轻松地转移颗粒的实用建议是用一把剪刀从移液器尖端去除约0.3-0.5毫米,允许将较大的颗粒吸入并释放到壳瓶中。这种转移方法是所有氨基酸分析中蛋白质提取的常用方法。然而,应研究修改以提高定量将颗粒转移到壳瓶中的效率和准确性。
可以使用两种形式的水解技术将氨基酸从其蛋白质结合状态释放出来:液相水解和酸蒸气水解。液相水解涉及将6M HCl添加到样品上,然后将其置于110°C的烘箱中过夜,是本协议中描述的酸蒸气水解的替代方案。采用液相水解的提取技术可能需要进一步处理,例如脱盐,特别是如果选择AQC衍生化,因为它需要标记的基本条件40。酸蒸气水解避免了脱盐,并允许用户在过滤前重新配制最终颗粒时自由选择衍生化技术。此外,与所选的水解方法无关,样品可能需要进一步处理,例如用于基质纯化和浓度29,47,48的SPE,具体取决于衍生化技术和/或分析分析的选择(例如,反相LC-MS/MS与亲水相互作用液相色谱[HILIC] LC-MS/MS37).在该协议中,在20mM HCl中重建最终沉淀适用于通过市售氨基酸水解试剂盒39使用PCF试剂48进行衍生化(参见材料表)。AQC和PCF均可衍生样品中存在的所有氨基酸、蛋白质和非蛋白质来源,并且通过使用LC-MS/MS及其保留时间匹配以及定量剂和限定剂MRMs38的仔细选择的组合来获得分析物的选择性。
目前的水解方案尚未针对BMAA,2,4-DAB和AEG的释放进行优化,而是针对基于现有蛋白质水解方法的22种蛋白质氨基酸进行优化32,其中孵育超过18小时会导致某些氨基酸的降解和修饰,从而影响LC-MS / MS分析,从而影响获得的浓度32。Beach等人49 研究了随时间(0.5-120小时)的水解,以优化水解以分析BMAA和蛋白质氨基酸。他们发现,尽管在水解的前0.5小时内BMAA的早期快速释放,但BMAA水平随着水解时间的增加而继续增加,即使在5天后也没有降解49。关于结合的BMAA及其异构体的真实性质,仍然存在不同的观点和问题,一些研究表明,BMAA与蛋白质的结合不是50,51 或错误掺入蛋白质14,而是肤浅的52。然而,目前在分析“结合”BMAA方面的共识需要经过验证和广泛接受的水解步骤,该步骤分解肽/蛋白质以释放氨基酸,从而释放BMAA及其异构体。
Sedgwick等人42 使用TCA提取法测定了20种蛋白质氨基酸的回收率,导致约100%的回收率。就藻类基质中的BMAA及其异构体而言,比较使用各种提取溶剂提取BMAA效率的研究发现,10%TCA对于游离BMAA27是最有效的。Glover等人25 和Faassen等人53的研究确定了使用液相水解提取的蛋白质结合BMAA的回收率,其中准确性通过加标回收方法确定,平均BMAA回收率分别为108.6%和70%。Faassen等人描述了尖峰回收实验的程序,并说明了回收率如何根据提取过程的阶段而有所不同53。Faassen等人还确定了此处介绍的酸蒸气方案的效率,萃取前加标的BMAA异构体的回收率为83.6%,水解前加标的BMAA异构体的回收率为68.6%24。Banack 26进一步验证了这些回收率、提取方法和分析,蓝藻基质中BMAA的回收率为94%-106%,相对标准偏差(%RSD)在5.6%至20%之间,符合FDA的准确性标准54。建议每个实验室在通过尖峰回收实验 使用 本协议之前首先确定其回收率和准确性。Faassen等人53 和Glover等人25 中提出的回收方法可以作为指导。
可以使用替代形式的水解技术代替过夜烘箱水解,以更快地提取分析物的蛋白质结合。例如,微波提取器可以将水解时间从24小时显着减少到10分钟55。氨基酸的微波水解使用与传统热法相同的原理,使用手套箱在无氧环境中制备和组装微波容器,并加入6 M HCl。一旦气密,装有样品的容器就会受到微波辐射。微波水解已被用于从各种样品基质中提取氨基酸56,57,58;然而,微波水解尚未开发和验证用于BMAA的分析。
总之,10%的TCA水性蛋白质沉淀是从蓝藻基质中提取游离非蛋白质氨基酸的最佳方法27,热水解提供了蛋白质结合级分的可靠且可重现的提取。这种从蓝藻中提取NPAA BMAA及其异构体的方案已经过验证并被广泛接受。进一步优化BMAA提取的未来方向将集中在水解步骤上,该步骤是根据22种蛋白质氨基酸的规格进行的。然而,这里介绍的提取方案对于通过LC-MS/MS 分析 BMAA及其异构体仍应被认为是高效和有效的。
The authors have nothing to disclose.
D.P.B.、K.J.R.和S.M.M.得到了伊恩·波特基金会的支持,JPV是澳大利亚政府研究培训计划Squalend的获得者。
1 mL glass shell vials | SHIMADZU | REST-24663 | |
10% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA | ||
100% TCA solution | Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O) | ||
1000 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z683809 | |
13.3% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA | ||
2 mL tubes | MERCK | BR780546-500EA | |
20 mM HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
20-200 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z740441 | |
6 M HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
70% ethanol | Supelco | 1.11727 | Dilute 70:1 Ethanol:water |
-80 °C Freezer | Martin CHRIST | 102142 | Alpha 2-4 Ldplus |
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit | Waters | 186003836 | |
Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | 34967-2.5L | |
Analytical Scale Balance | |||
Centrifugal evaporator | Thermo Scientific | 13442549 | DNA120-115 SpeedVac Concentrator |
Centrifuge | MERCK | EP022620100-1EA | |
D5-2,4-DAB standard | CDN Isotopes | D-7568 | |
Drying Oven | |||
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit | Phenomenex | CEO-8492 | |
Falcon tube holder | |||
Falcon Tubes | MERCK | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes |
Filter Tubes | Sigma-Aldrich | CLS8161-100EA | Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm) |
Glass engraver | |||
Hydrolysis vial & Lid | Eldex Laboratories/Waters | WAT007568 & WAT007569 | |
Ice and container | |||
Lint-free paper wipe | Kimwipes/Sigma-Aldrich | Z188956 | |
Milli-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
Nitrogen tap with hose | |||
P1000 Micropipette | MERCK | EP3123000063 | |
P1000 pipette tips | MERCK | Z740127 | |
P200 Micropipette | MERCK | EP3123000055-1EA | |
P200 pipette tips | MERCK | Z740125 | |
Parafilm | MERCK | P7793 | Sealing film |
PPE – noise cancelling headphones | |||
PPE – oven gloves | |||
Probe sonicator | QSONICA Sonicators | Q125 Sonicator | Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones) |
Sample transfer spatula | |||
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399-1KG | |
Tweezers | |||
Vacuum Pump with hose |