Denne protokol beskriver ekstraktionen af ikke-proteinaminosyrer fra biologiske matricer via trichloreddikesyre (TCA) proteinudfældning og syrehydrolyse før analyse ved anvendelse af væskekromatografi-tandem massespektrometri.
Ikke-proteinaminosyrer (NPAA’er) er en stor klasse af aminosyrer (AA’er), der ikke er genetisk kodet til oversættelse til proteiner. Analysen af NPAA’er kan give afgørende information om cellulær optagelse og / eller funktion, metaboliske veje og potentiel toksicitet. β-methylamino-L-alanin (BMAA) er en neurotoksisk NPAA produceret af forskellige algearter og er forbundet med en øget risiko for neurodegenerative sygdomme, hvilket har ført til betydelig forskningsinteresse. Der er mange måder at ekstrahere AA’er til analyse, hvor væskekromatografi-tandem massespektrometri er den mest almindelige, hvilket kræver proteinudfældning efterfulgt af syrehydrolyse af proteinpellet. Undersøgelser af tilstedeværelsen af BMAA hos algearter giver modstridende resultater, hvor anvendelse af ikke-valideret prøveforberedelse/ekstraktion og analyse er en primær årsag. Som de fleste NPAA’er er proteinudfældning i 10% vandig TCA og hydrolyse med rygende HCI den mest passende form for ekstraktion til BMAA og dets isomerer aminoethylglycin (AEG) og 2,4-diaminosmørsyre (2,4-DAB). Den nuværende protokol beskriver trinene i en valideret NPAA-ekstraktionsmetode, der almindeligvis anvendes i forsknings- og undervisningslaboratorier.
Aminosyrer er kemiske forbindelser, der indeholder mindst en amin- og carboxylfunktionel gruppe. Nogle aminosyrer indeholder også en iminogruppe, en funktionel syregruppe bortset fra carboxyl; Andre aminosyrer har amingrupper, der ikke er bundet til α-carbon-gruppe1. Der er over 500 aminosyrer2, hvoraf 22 er kendt som proteinaminosyrer, der anvendes til genetisk kodning i ribosomal proteinsyntese3. Disse 22 aminosyrer kan yderligere opdeles i essentielle og ikke-essentielle. Essentielle aminosyrer er nødvendige for, at en organisme kan fungere korrekt og kan kun erhverves af eksterne kilder. Ikke-essentielle aminosyrer kan syntetiseres i organismen. Klassificeringen af de 22 aminosyrer i essentielle /ikke-essentielle er unik for individuelle arter. Alle andre aminosyrer er ikke-proteinaminosyrer (NPAA’er), der ikke er kodet til proteinsyntese. Aminosyrer, hvad enten de er protein- eller ikke-proteinfattige, kan også spille en signalrolle i en organisme og fungere som metaboliske mellemled4. På grund af deres vigtige og varierende roller kan aminosyreniveauer give et indblik i organismens tilstand, funktionalitet og metaboliske veje osv. Der er to hovedmekanismer, hvormed aminosyrer kan inkorporeres i en polypeptidkæde: ribosomal proteinsyntese, der udnytter de 22 aminosyrer i kodning, og ikke-ribosomal peptidsyntese, som sammen med proteinaminosyrer giver mulighed for anvendelse af nogle NPAA’er i syntese. Visse NPAA’er kan efterligne proteinaminosyrer, hvilket potentielt kan føre til deres misinkorporering i peptider og proteiner. Misinkorporeringen forårsager en fejlfoldning af proteiner, som igen har skadelige virkninger5, såsom fejlinkorporering af NPAA L-3,4 dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) i stedet for tyrosin, negativt påvirker cellulær funktion og sundhed 6,7. En yderligere kilde til inkorporerede NPAA’er er gennem posttranslationel modifikation (PTM) af aminosyrerester. Aminosyrerester modificeres af forskellige årsager, herunder ændringer i peptid- eller proteinkonformation, stabilitet og funktionalitet. Ved hydrolyse af PTM-holdigt protein eller peptider frigives disse modificerede aminosyrerester i deres frie NPAA-form 8,9.
NPAA β-methylamino-L-alanin (BMAA) produceret af cyanobakterier, diatomer og dinoflagellater10 er et mistænkt neurotoksin, der er impliceret som en medvirkende faktor til forskellige neurodegenerative sygdomme såsom amyotrofisk lateral sklerose / parkinsonisme-demenskompleks (ALS-PDC) 11,12, amyotrofisk lateral sklerose og Alzheimers sygdom 13 . Det foreslås, at BMAA fejlagtigt inkorporeres i polypeptidkæden af proteiner i stedet for L-serin14 og / eller andre proteinaminosyrer. Misinkorporeringen af BMAA kan føre til fejlfoldning af proteiner, hvilket resulterer i aflejring af proteinaggregater i neuroner14. I det sidste årti er interessen for BMAA steget betydeligt. En bred vifte af cyanobakterielle arter fra ferskvands-, marine- og brakvandsmiljøer er blevet opdaget at producere BMAA15, hvilket fører til deres udbredte distribution i forskellige økosystemer16,17. Derudover har BMAA vist sig at biomagnificere gennem fødekæden til det menneskelige fødenet18,19. På grund af de potentielle sundhedseffekter, manglende forståelse og inkongruenser af BMAA-toksicitet er det bydende nødvendigt at fortsætte yderligere forskning, indtil enten BMAA’s toksicitet i sidste ende forstås, eller BMAA anses for sikker20,21.
Analysen af aminosyrer i biologiske prøver kan opdeles i fire hovedtrin: prøveforberedelse, aminosyrederivatisering, adskillelse og påvisning samt identifikation og kvantificering. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) er den foretrukne analysemetode, da den giver en målrettet og reproducerbar adskillelse og analyse af aminosyrer.
Prøveforberedelsesteknikker til analyse af cyanobakterielle og andre algeprøver involverer overvejende en ekstraktionsmetode for aminosyrer i deres frie og proteinbundne former. I årenes løb har ekstraktionsmetoderne været relativt i overensstemmelse med almindelige elementer, herunder opløsning af prøven for at adskille de frie aminosyrer fra deres bundne form efterfulgt af proteinudfældning og frigivelse af de bundne aminosyrer gennem hydrolyse med saltsyre (HCI) ved forhøjede temperaturer22 . Denne ekstraktionsform er blevet optimeret til proteinaminosyrer og anvendes til NPAA’er. Påvisning og kvantificering af BMAA og dets isomerer (figur 1), aminoethylglycin (AEG) og 2,4-diaminosmørsyre (2,4-DAB) i samme art af cyanobakterier har imidlertid vist inkonsekvente resultater i litteraturen, hvor en mulig forklaring ligger i forskelle i vækstbetingelserne og/eller algestammen, der producerer varierende eller ingen mængder BMAA23 . Det er blevet fremført, at en mere sandsynlig forklaring på uoverensstemmelserne i påvisning og kvantificering af BMAA og dets isomerer skyldes ikke-validerede forsøgsprotokoller, anvendelsen af en lang række analytiske teknikker og utilstrækkelige eksperimentelle detaljer i de rapporterede metoder16,24, der fører til irreproducerbare data mellem laboratorier. Glover et al.25 og Banack 26 har imidlertid for nylig udviklet og valideret en analytisk teknik til påvisning og kvantificering af BMAA og dets isomerer ved hjælp af ultra-performance væskekromatografi (UPLC)-MS/MS i overensstemmelse med International Society of Analytical Chemists (AOAC), US Pharmacopeia og FDA-retningslinjer, der er nødvendige for validering af enkeltlaboratorier.
Disse valideringseksperimenter fokuserede på adskillelse og påvisning af BMAA og dets isomerer og adresserede ikke uoverensstemmelserne i prøveforberedelsesprotokoller. Lage et al.27 sammenlignede udførelsen af tre almindelige ekstraktionsmetoder til kvantificering af BMAA og dets isomerer i cyanobakterielle prøver via LC-MS/MS: fastfaseekstraktion (SPE) af frie aminosyrer28,29; en proteinudfældningsmetode, der involverer en methanolekstraktion og acetoneudfældning30 og den mest almindeligt anvendte ekstraktionsmetode til BMAA, proteinudfældning med trichloreddikesyre (TCA)31. De konkluderede, at TCA-proteinudfældningen var den optimale protokol, hvilket gav højere BMAA-koncentrationer i testprøverne sammenlignet med de andre ekstraktionsmetoder. Deres undersøgelse validerede TCA-ekstraktion med derivatisering af BMAA ved anvendelse af 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat (AQC) i en cyanobakteriematrix, hvilket giver en etableret vejledning til opnåelse af pålidelige og reproducerbare BMAA-data. TCA aminosyreekstraktion er en accepteret og almindelig prøveforberedelsesteknik, der også kan anvendes på andre matricer. Imidlertid skal stabiliteten af aminosyren under hydrolyse overvejes for at forhindre nedbrydning eller oxidation, som kan overvindes ved anvendelse af kemiske modifikatorer og reduktionsmidler32. TCA-ekstraktion bruges rutinemæssigt og undervises til nye forskerstuderende, og selvom protokollen er bredt rapporteret, er et visuelt hjælpemiddel i anvendelsen af denne metode en værdifuld ressource, der sikrer korrekt og konsekvent udførelse.
Omvendt fasekromatografi bruges almindeligvis til at adskille aminosyrer, hvilket kræver et derivatiseringstrin før analyser. Afledningen af aminosyrer såsom BMAA giver mulighed for kromatografisk retention og kan øge opløsningen mellem isomerer. Det øger også molekylmassen og forbedrer ioniseringen i massespektrometeret. Flere derivatiseringsreagenser er blevet anvendt til analyse af aminosyrer via LC-MS/MS, herunder propylchloroformat (PCF)33, 6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidylcarbamat (AQC)27, 9-fluorenylmethylchloroformat (FMOC)34 og dansylchlorid (DC)35. De eneste validerede teknikker til analyse af BMAA brugte imidlertid enten PCF 36 eller AQC24,26,37 som deres derivatiseringsreagens.
Omfanget af denne protokol er fokuseret på TCA-ekstraktion af NPAA’er fra cyanobakterielle matricer. Det er en arbejdskrævende metode, der rutinemæssigt bruges og undervises i akademiske og industrielle forskningslaboratorier baseret på manuskripter, der kan være korte på detaljer; derfor giver denne protokol detaljer om proceduren og teknikkerne, der er involveret i fremstilling af prøver til analyse af fri og bundet BMAA som modelaminosyre.
Ekstraktionsprotokollen, der er skitseret her til analyse af NPAA’er, gælder for analyse af aminosyrer i biologiske prøver. For vejledninger om isolering og dyrkning af cyanobakterielle stammer kan man henvise til de metoder, der præsenteres i undersøgelsen af Violi et al.38. Det første trin i protokollen tager prøven til et punkt, hvor normalisering mellem prøver mod tørvægten kan opnås. Det andet trin er cellelyse for at frigive analysanderne og kan udføres ved hjælp af en række teknikker, herunder mekaniske forstyrrelser / lyser såsom sonde sondering som beskrevet i denne protokol, fryse- / optøningscyklusser, slibning og perlefræsning og ikke-mekaniske forstyrrelser såsom enzymatisk, vaskemiddel og / eller kemisk lyse. Mekanisk forstyrrelse er kendt for at være fordelagtig i forhold til ikke-mekanisk, da det giver mulighed for en større kapacitet af prøven til at lyse, samtidig med at de intracellulære bindinger og proteiner forbliver intakte41, selvom prøvematrixen kan diktere den optimale metode til cellelysning.
Proteinudfældning er det kritiske tredje trin i denne protokol, når aminosyrer ekstraheres til analyse. TCA er det mest almindeligt anvendte opløsningsmiddel; Der er dog også anvendt perchlorsyre, acetone, methyltert-butylether (MTBE), methanol og/eller acetonitril 8,42, hvor hvert ekstraktionsopløsningsmiddel har til formål at ekstrahere og udfælde forskellige substrater. Den her beskrevne model ekstraherer NPAA BMAA og dets isomerer fra en cyanobakteriel matrix, og selvom der er anvendt en række forskellige opløsningsmidler, er de to mest almindelige 10% TCA i vand (vandig) og 10% TCA i acetone. Generelt er proteinudfældning med TCA almindeligt anvendt til at ekstrahere aminosyrer til fraktionering af frie aminosyrer fra de proteinbundne aminosyrer. Derudover giver TCA-ekstraktion mulighed for at bestemme det samlede proteinindhold, reducere forurenende stoffer til den frie fraktion og reducere proteasernes aktivitet med minimal proteinnedbrydning43. TCA-ekstraktionen af den frie fraktion virker ved først at skylle organisk opløselige stoffer ud og efterlade proteiner og uopløselige forbindelser såsom cellevægsrester i bundfaldet, som derefter efterfølges af termisk hydrolyseekstraktion af de proteinbundne aminosyrer (bundet fraktion) ved anvendelse af en stærk syre.
Fraktioneringen af den frie fraktion med 10% vandig TCA plus sonikering producerer den mest omfattende proteinudfældning sammenlignet med andre organiske opløsningsmidler44 og den bedste aminosyregenvinder42. Nogle undersøgelser vælger at bruge en syre kombineret med et organisk opløsningsmiddel (dvs. 10% -20% TCA i acetone 43) til at udfælde flere molekyler, herunder mindre peptider / biomolekyler, minimere proteinnedbrydning og reducere forurenende stoffer såsom salte43. En anden fordel ved 10% TCA i acetone er dens hurtigere tørringshastighed ved fremstilling af pellet til hydrolyse, hvilket minimerer fugtrester for at forhindre aminosyremodifikation. Imidlertid har 10% vandig TCA plus sonikering bedre ekstraktionseffektivitet af frie aminosyrer sammenlignet med 10% TCA i acetone44 alene. Derudover har 10% vandig TCA-udfældning begrænsninger såsom en lang tørretid, ikke at være i stand til at udfælde alle proteiner eller små peptider / biomolekyler og afhængigt af analytten af interesse (dvs. proteiner eller aminosyrer), der kræver additiver og reduktionsmidler for at forhindre oxidation og nedbrydning45,46.
Denne protokol bruger en kombination af 10% vandig TCA og 10% TCA i acetone for at øge proteinudfældningen, sikre, at mindre peptider / biomolekyler udfældes, giver mulighed for hurtigere pellettørringstider og øger ekstraktionseffektiviteten, idet man drager fordel af begge opløsningsmiddelekstraktionsegenskaber. Kombinationen af 10% vandig TCA og 10% TCA i acetone kan imidlertid udfælde små peptider / biomolekyler i den frie fraktion, efter at 10% TCA i acetonesupernatant kombineres med den vandige frie fraktion. I dette tilfælde skal bundfaldene overføres til den bundne fraktion til hydrolyse.
Den anden halvdel af denne protokol involverer frigivelse af aminosyrer (dvs. BMAA) fra proteinpellet via syre-damphydrolyse ved forhøjede temperaturer i et iltfrit miljø. Den overvejende begrænsende faktor for hydrolysetrinnet er, at det er tidskrævende og besværligt at forberede. Inkubationen natten over forhindrer hurtig og tidseffektiv prøveforberedelse og analyse. Derudover er den kvantitative overførsel af pelleten fra et centrifugerør til et hætteglas (trin 3.4) en vanskelig proces, der kræver omhu og tålmodighed for at sikre et nøjagtigt normaliseringspunkt til tørvægten. Mulige problemer, som brugeren kan stå over for, er ufuldstændig overførsel af pellet, våde udfældede proteiner, der klæber til pipettespidser og det originale rør, og faste partikler af pelleten, der blokerer pipettespidsen. Et praktisk forslag til at hjælpe med en lettere overførsel af pelleten er at fjerne ca. 0,3-0,5 mm fra enden af pipettespidsen med en saks, så større pelletspartikler kan trækkes og frigives i hætteglasset med skallen. Denne overførselsmetode er almindelig praksis for proteinekstraktion for alle aminosyreanalyser. Ændringer for at forbedre effektiviteten og nøjagtigheden af kvantitativ overførsel af pelleten til hætteglasset med skal bør dog undersøges.
To former for hydrolyseteknikker kan anvendes til at frigive aminosyrer fra deres proteinbundne tilstand: væskefasehydrolyse og syredamphydrolyse. Væskefasehydrolyse, som indebærer tilsætning af 6 M HCI til prøven, som derefter anbringes i en 110 °C ovn natten over, er et alternativ til syre-damphydrolysen beskrevet i denne protokol. Ekstraktionsteknikker, der anvender væskefasehydrolyse, kan kræve yderligere behandling, såsom afsaltning, især hvis AQC-derivatisering vælges, da det kræver grundlæggende betingelser for mærkningaf 40. Syre-damphydrolyse undgår afsaltning og giver brugeren frihed til at vælge derivatiseringsteknikken ved rekonstitution af den endelige pellet inden filtrering. Uafhængigt af den valgte hydrolysemetode kan prøverne desuden kræve yderligere behandling, såsom SPE til matrixrensning og koncentration 29,47,48, afhængigt af valget af derivatiseringsteknik og/eller analytisk analyse (f.eks. omvendt fase LC-MS/MS vs. hydrofil interaktionsvæskekromatografi [HILIC] LC-MS/MS 37 ). Rekonstitutionen af den endelige pellet i 20 mM HCI i denne protokol er egnet til derivatisering ved anvendelse af PCF-reagenser48via et kommercielt tilgængeligt aminosyrehydrolysesæt39 (se materialetabel). Både AQC og PCF vil aflede alle aminosyrer, protein og ikke-protein i oprindelse, der er til stede i prøven, og analysandernes selektivitet opnås ved brug af LC-MS / MS og dens kombination af retentionstidsmatchning og omhyggelig udvælgelse af kvantifikatoren og kvalifikatorenMRMs 38.
Nuværende hydrolyseprotokoller er ikke optimeret til frigivelse af BMAA, 2,4-DAB og AEG, men til de 22 proteinaminosyrer baseret på eksisterende metoder til proteinhydrolyse 32, hvor inkubation i mere end 18 timer resulterer i nedbrydning og modifikation af visse aminosyrer, der påvirker LC-MS / MS-analyse og dermed de opnåede koncentrationer32. Beach et al.49 undersøgte hydrolyse over tid (0,5-120 timer) for at optimere hydrolyse til analyse af BMAA og de proteinogene aminosyrer. De fandt ud af, at selvom der var en tidlig hurtig frigivelse af BMAA i løbet af de første 0,5 timer af hydrolysen, fortsatte BMAA-niveauerne med at stige, da hydrolysetiden steg uden nedbrydning, selv efter 5 dage49. Der er også stadig forskellige synspunkter og spørgsmål om den sande natur af bundet BMAA og dets isomerer, hvor nogle undersøgelser tyder på, at BMAA-proteinforeningen i stedet for BMAA-binding50,51 eller forkert inkorporering i protein14 er overfladisk 52. Den nuværende konsensus i analysen af “bundet” BMAA kræver imidlertid det validerede og bredt accepterede hydrolysetrin, der nedbryder peptider / proteiner for at frigive aminosyrer og dermed BMAA og dets isomerer.
Genvindingshastighederne for 20 proteinaminosyrer blev bestemt i en undersøgelse af Sedgwick et al.42 ved anvendelse af TCA-ekstraktion, hvilket resulterede i ca. 100% genopretning. I tilfælde af BMAA og dets isomerer fra algematricer har undersøgelser, der sammenligner effektiviteten af BMAA-ekstraktion ved hjælp af forskellige ekstraktionsmidler, fundet, at 10% TCA er den mest effektive gratis BMAA27. Gendannelseshastighederne for proteinbundet BMAA ekstraheret ved anvendelse af væskefasehydrolyse blev fastlagt i undersøgelser af Glover et al.25 og af Faassen et al.53, hvor nøjagtigheden blev bestemt ved spikede genopretningsmetoder med en gennemsnitlig BMAA-genopretningshastighed på henholdsvis 108,6% og 70%. Faassen et al. beskrev procedurer for spike-recovery eksperimenter og illustrerede, hvordan genopretningen varierer afhængigt af det stadium af ekstraktionsprocessen, spidsen blev foretaget53. Faassen et al. bestemte desuden effektiviteten af syre-dampprotokollen, der præsenteres her, med genvindingshastigheder på 83,6% for BMAA-isomerer, der er spidset før ekstraktion og 68,6% for dem, der er spidset før hydrolyse24. Disse gendannelser, ekstraktionsmetoder og analyser blev yderligere valideret af Banack 26 med genvindingsrater på 94% -106% for BMAA i en cyanobakteriel matrix og en% relativ standardafvigelse (% RSD) mellem 5,6% og20%, der opfylder FDA-kriterierne for nøjagtighed54. Det anbefales, at hvert laboratorium først fastlægger sine gendannelseshastigheder og nøjagtighed, før de bruger denne protokol via spike recovery eksperimenter. De genfindingsmetoder, der er præsenteret i Faassen et al.53 og Glover et al.25 , kan følges som vejledning.
Alternative former for hydrolyseteknikker kan anvendes i stedet for ovnhydrolyse natten over for hurtigere proteinbundet ekstraktion af analysanden. For eksempel kan en mikrobølgeudsugning reducere hydrolysetiden betydeligt fra 24 timer til så lidt som 10 minutter55. Mikrobølgehydrolyse for aminosyrer bruger de samme principper som den konventionelle termiske metode ved hjælp af et handskerum til at forberede og samle mikrobølgebeholderen i et iltfrit miljø og tilføje 6 M HCI. Når beholderen indeholder prøven, er lufttæt, gennemgår den mikrobølgestråling. Mikrobølgehydrolyse er blevet brugt til at ekstrahere aminosyrer fra forskellige prøvematricer56,57,58; Mikrobølgehydrolyse er dog endnu ikke udviklet og valideret til analyse af BMAA.
Afslutningsvis er 10% vandig TCA-proteinudfældning den optimale metode til at ekstrahere frie ikke-proteinaminosyrer fra cyanobakterielle matricer27, og termisk hydrolyse giver en pålidelig og reproducerbar ekstraktion af den proteinbundne fraktion. Denne protokol til ekstraktion af NPAA BMAA og dets isomerer fra cyanobakterier er valideret og bredt accepteret. Fremtidige retninger for yderligere at optimere ekstraktionen af BMAA vil fokusere på hydrolysetrinnet, som udføres i henhold til specifikationerne for de 22 proteinaminosyrer. Den ekstraktionsprotokol, der præsenteres her, bør dog stadig betragtes som effektiv og effektiv til analyse af BMAA og dets isomerer via LC-MS / MS.
The authors have nothing to disclose.
D.P.B., K.J.R. og S.M.M. er støttet af The Ian Potter Foundation, og J.P.V. er modtager af et australsk regerings forskningsuddannelsesprogram, Stipend.
1 mL glass shell vials | SHIMADZU | REST-24663 | |
10% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA | ||
100% TCA solution | Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O) | ||
1000 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z683809 | |
13.3% TCA solution | Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA | ||
2 mL tubes | MERCK | BR780546-500EA | |
20 mM HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
20-200 µL micropipette | Ependorf/Sigma-Aldrich | Z740441 | |
6 M HCl | Chem-Supply Pty Ltd | 7647-01-0 | Made from stock |
70% ethanol | Supelco | 1.11727 | Dilute 70:1 Ethanol:water |
-80 °C Freezer | Martin CHRIST | 102142 | Alpha 2-4 Ldplus |
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit | Waters | 186003836 | |
Acetone | Chem-Supply Pty Ltd | 34967-2.5L | |
Analytical Scale Balance | |||
Centrifugal evaporator | Thermo Scientific | 13442549 | DNA120-115 SpeedVac Concentrator |
Centrifuge | MERCK | EP022620100-1EA | |
D5-2,4-DAB standard | CDN Isotopes | D-7568 | |
Drying Oven | |||
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit | Phenomenex | CEO-8492 | |
Falcon tube holder | |||
Falcon Tubes | MERCK | T2318-500EA | Greiner centrifuge tubes |
Filter Tubes | Sigma-Aldrich | CLS8161-100EA | Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm) |
Glass engraver | |||
Hydrolysis vial & Lid | Eldex Laboratories/Waters | WAT007568 & WAT007569 | |
Ice and container | |||
Lint-free paper wipe | Kimwipes/Sigma-Aldrich | Z188956 | |
Milli-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
Nitrogen tap with hose | |||
P1000 Micropipette | MERCK | EP3123000063 | |
P1000 pipette tips | MERCK | Z740127 | |
P200 Micropipette | MERCK | EP3123000055-1EA | |
P200 pipette tips | MERCK | Z740125 | |
Parafilm | MERCK | P7793 | Sealing film |
PPE – noise cancelling headphones | |||
PPE – oven gloves | |||
Probe sonicator | QSONICA Sonicators | Q125 Sonicator | Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones) |
Sample transfer spatula | |||
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399-1KG | |
Tweezers | |||
Vacuum Pump with hose |