La microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM) permite obtener imágenes de superresolución y etiquetado de alta eficiencia
Summary
Se demuestra un protocolo de microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM). LR-ExM utiliza un novedoso conjunto de anclajes trifuncionales, que proporciona una mejor eficiencia de etiquetado en comparación con las microscopías de expansión introducidas anteriormente.
Abstract
La microscopía de expansión (ExM) es una técnica de preparación de muestras que se puede combinar con la mayoría de los métodos de microscopía óptica para aumentar la resolución. Después de incrustar células o tejidos en hidrogel hinchable, las muestras se pueden expandir físicamente de tres a dieciséis veces (dimensión lineal) en comparación con el tamaño original. Por lo tanto, la resolución efectiva de cualquier microscopio se incrementa por el factor de expansión. Una limitación importante del ExM introducido previamente es la reducción de la fluorescencia después de la polimerización y el procedimiento de digestión. Para superar esta limitación, se ha desarrollado la microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM), que evita la pérdida de señal y mejora en gran medida la eficiencia del etiquetado utilizando un conjunto de nuevos anclajes trifuncionales. Esta técnica permite lograr una resolución más alta cuando se investigan estructuras celulares o subcelulares a escala nanométrica con una pérdida mínima de señal fluorescente. LR-ExM se puede utilizar no solo para el etiquetado de inmunofluorescencia, sino también con etiquetas de proteínas automarcantes, como las etiquetas SNAP y CLIP, logrando así una mayor eficiencia de etiquetado. Este trabajo presenta el procedimiento y la solución de problemas para este enfoque basado en la inmunotinción, así como la discusión de los enfoques de etiquetado automático de LR-ExM como alternativa.
Introduction
La microscopía de expansión (ExM) ha sido utilizada por los investigadores desde que se introdujo por primera vez como un enfoque conveniente para lograr imágenes de súper resolución con microscopios convencionales, como los microscopios de epifluorescencia y confocales 1,2,3,4,5,6,7 . Usando ExM, es posible lograr una resolución lateral de ~70 nm incluso con microscopios confocales regulares. Cuando ExM se combina con imágenes de súper resolución, la resolución se mejora aún más. Por ejemplo, se puede lograr una resolución de aproximadamente 30 nm con microscopía de iluminación estructurada (SIM), y una resolución de aproximadamente 4 nm con microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM)1,5.
Sin embargo, la baja eficiencia de etiquetado es un problema crítico con los métodos ExM estándar. La pérdida de fluorescencia puede variar según el tipo de grupos fluorescentes y el tiempo de digestión. En promedio, sin embargo, se ha relatado que más del 50% de los fluoróforos se pierden después de la polimerización y los pasos de digestión de proteínas de ExM, lo que es perjudicial para la calidad de la imagen 3,4.
Por lo tanto, se ha desarrollado la microscopía de expansión de retención de etiquetas (LR-ExM), que puede retener etiquetas de manera eficiente y reducir la pérdida de señal1. La innovación clave de LR-ExM es el uso de un conjunto de anclajes trifuncionales en lugar de simplemente usar colorantes fluorescentes, como en el procedimiento estándar ExM, para teñir proteínas de interés. Estos enlazadores trifuncionales constan de tres partes: (1) el conector (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS)) para conectarse al anticuerpo, (2) el anclaje (por ejemplo, metacrilamida (MA)) para anclar proteínas al polímero, y (3) el informador (por ejemplo, biotina o digoxigenina (DIG)) para conjugar a un colorante orgánico. Los anclajes trifuncionales sobreviven a los pasos de polimerización y digestión de proteínas y, por lo tanto, evitan la pérdida de fluoróforos.
Además, este método tiene un gran potencial ya que es compatible con etiquetas enzimáticas autoetiquetadas como SNAP o CLIP. Los enfoques de etiquetas enzimáticas tienen algunos beneficios sobre el enfoque de inmunotinción con respecto a la alta especificidad y la eficiencia de etiquetado 8,9,10.
En este manuscrito, se demuestra un procedimiento detallado de LR-ExM. LR-ExM es un método altamente efectivo y flexible para lograr una alta resolución espacial con una mayor eficiencia de etiquetado.
Protocol
Representative Results
Discussion
La innovación clave de LR-ExM es utilizar anclajes trifuncionales para etiquetar eficazmente las proteínas diana y mejorar la calidad de imagen. Este método está limitado por anclajes trifuncionales, que no están tan fácilmente disponibles para los investigadores. Sin embargo, los anclajes trifuncionales se pueden compartir con otros investigadores a pedido, y productos similares como las sondas ExM de Chrometa ahora también están disponibles comercialmente.
En este protocolo, se ha re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R00 GM126136 a X.S.), la Fundación Nacional de Ciencias de los Estados Unidos (DMS1763272 a S.P.) y la Fundación Simons (594598 a S.P.).
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
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