La microscopie à extension de rétention d’étiquettes (LR-ExM) permet l’imagerie à super-résolution et le marquage à haute efficacité
Summary
Un protocole de microscopie à expansion de rétention d’étiquettes (LR-ExM) est démontré. LR-ExM utilise un nouvel ensemble d’ancrages trifonctionnels, qui offre une meilleure efficacité d’étiquetage par rapport aux microscopies à expansion précédemment introduites.
Abstract
La microscopie à expansion (ExM) est une technique de préparation d’échantillons qui peut être combinée avec la plupart des méthodes de microscopie optique pour augmenter la résolution. Après avoir incorporé des cellules ou des tissus dans de l’hydrogel gonflable, les échantillons peuvent être physiquement dilatés de trois à seize fois (dimension linéaire) par rapport à la taille d’origine. Par conséquent, la résolution effective de tout microscope est augmentée par le facteur d’expansion. Une limitation majeure de l’ExM précédemment introduit est la fluorescence réduite après la polymérisation et la procédure de digestion. Pour surmonter cette limitation, la microscopie à expansion de rétention de marquage (LR-ExM) a été développée, qui empêche la perte de signal et améliore considérablement l’efficacité du marquage à l’aide d’un ensemble de nouveaux ancrages trifonctionnels. Cette technique permet d’atteindre une résolution plus élevée lors de l’étude de structures cellulaires ou subcellulaires à l’échelle nanométrique avec une perte minimale de signal fluorescent. LR-ExM peut être utilisé non seulement pour le marquage par immunofluorescence, mais aussi avec des marqueurs de protéines auto-étiquetés, tels que les marqueurs SNAP et CLIP, obtenant ainsi une efficacité de marquage plus élevée. Ce travail présente la procédure et le dépannage de cette approche basée sur l’immunomarquage, ainsi que la discussion des approches d’auto-marquage du LR-ExM comme alternative.
Introduction
La microscopie à expansion (ExM) est utilisée par les chercheurs depuis qu’elle a été introduite pour la première fois comme une approche pratique pour obtenir une imagerie à super résolution avec des microscopes conventionnels, tels que l’épifluorescence et les microscopes confocaux 1,2,3,4,5,6,7 . En utilisant ExM, il est possible d’atteindre une résolution latérale de ~ 70 nm même avec des microscopes confocaux réguliers. Lorsque l’ExM est combiné à l’imagerie à super-résolution, la résolution est encore améliorée. Par exemple, on peut atteindre une résolution d’environ 30 nm avec la microscopie à illumination structurée (SIM) et une résolution d’environ 4 nm avec la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM)1,5.
Cependant, la faible efficacité de l’étiquetage est un problème critique avec les méthodes ExM standard. La perte de fluorescence peut varier en fonction du type de groupes fluorescents et du temps de digestion. En moyenne, cependant, il a été rapporté que plus de 50% des fluorophores sont perdus après les étapes de polymérisation et de digestion des protéines de l’ExM, ce qui nuit à la qualité de l’imagerie3,4.
Ainsi, la microscopie à expansion de rétention de marquage (LR-ExM) a été développée, qui peut retenir efficacement les étiquettes et réduire la perte de signal1. L’innovation clé de LR-ExM est l’utilisation d’un ensemble d’ancrages trifonctionnels au lieu d’utiliser simplement des colorants fluorescents – comme dans la procédure ExM standard – pour colorer les protéines d’intérêt. Ces agents de liaison trifonctionnels se composent de trois parties : (1) le connecteur (p. ex., N-hydroxysuccinimide (NHS)) pour se connecter à l’anticorps, (2) l’ancrage (p. ex. méthacrylamide (MA)) pour ancrer les protéines au polymère, et (3) le rapporteur (p. ex. biotine ou digoxigénine (DIG)) pour se conjuguer à un colorant organique. Les ancrages trifonctionnels survivent aux étapes de polymérisation et de digestion des protéines, et empêchent ainsi la perte de fluorophore.
De plus, cette méthode présente un grand potentiel puisqu’elle est compatible avec les balises enzymatiques auto-étiquetantes telles que SNAP ou CLIP. Les approches de marquage enzymatique présentent certains avantages par rapport à l’approche d’immunomarquage en ce qui concerne la spécificité élevée et l’efficacité du marquage 8,9,10.
Dans ce manuscrit, une procédure détaillée de LR-ExM est démontrée. LR-ExM est une méthode très efficace et flexible pour atteindre une résolution spatiale élevée avec une efficacité d’étiquetage améliorée.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’innovation clé de LR-ExM est d’utiliser des ancrages trifonctionnels pour marquer efficacement les protéines cibles et améliorer la qualité de l’image. Cette méthode est limitée par des ancrages trifonctionnels, qui ne sont pas si facilement accessibles aux chercheurs. Cependant, les ancrages trifonctionnels peuvent être partagés avec d’autres chercheurs sur demande, et des produits similaires tels que les sondes ExM de Chrometa sont maintenant disponibles dans le commerce.
D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health des États-Unis (R00 GM126136 à X.S.), la National Science Foundation des États-Unis (DMS1763272 à S.P.) et la Simons Foundation (594598 à S.P.).
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M’Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
