Label-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) ermöglicht hochauflösende Bildgebung und hocheffiziente Markierung
Summary
Ein Protokoll der Markierungsretentionsexpansionsmikroskopie (LR-ExM) wird demonstriert. LR-ExM verwendet einen neuartigen Satz trifunktionaler Anker, der im Vergleich zu zuvor eingeführten Expansionsmikroskopien eine bessere Markierungseffizienz bietet.
Abstract
Die Expansionsmikroskopie (ExM) ist eine Probenvorbereitungstechnik, die mit den meisten lichtmikroskopischen Methoden kombiniert werden kann, um die Auflösung zu erhöhen. Nach dem Einbetten von Zellen oder Geweben in quellbares Hydrogel können die Proben im Vergleich zur ursprünglichen Größe physikalisch um das Drei- bis Sechzehnfache (lineare Dimension) erweitert werden. Daher wird die effektive Auflösung eines Mikroskops um den Expansionsfaktor erhöht. Eine wesentliche Einschränkung des zuvor eingeführten ExM ist die reduzierte Fluoreszenz nach der Polymerisation und dem Aufschlussverfahren. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde die Markierungs-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) entwickelt, die Signalverluste verhindert und die Markierungseffizienz mit einer Reihe neuartiger trifunktionaler Anker erheblich verbessert. Diese Technik ermöglicht es, eine höhere Auflösung zu erreichen, wenn zelluläre oder subzelluläre Strukturen im Nanometerbereich mit minimalem Fluoreszenzsignalverlust untersucht werden. LR-ExM kann nicht nur zur Immunfluoreszenzmarkierung, sondern auch mit selbstmarkierenden Proteinmarkierungen wie SNAP- und CLIP-Tags verwendet werden, wodurch eine höhere Markierungseffizienz erreicht wird. Diese Arbeit präsentiert das Verfahren und die Fehlerbehebung für diesen immunfärbungsbasierten Ansatz sowie die Diskussion von selbstmarkierenden Tagging-Ansätzen von LR-ExM als Alternative.
Introduction
Die Expansionsmikroskopie (ExM) wird von Forschern seit ihrer Einführung als bequemer Ansatz verwendet, um hochauflösende Bildgebung mit herkömmlichen Mikroskopen wie Epifluoreszenz und konfokalen Mikroskopen zu erreichen 1,2,3,4,5,6,7 . Mit ExM ist es möglich, auch mit normalen konfokalen Mikroskopen eine laterale Auflösung von ~70 nm zu erreichen. Wenn ExM mit hochauflösender Bildgebung kombiniert wird, wird die Auflösung weiter verbessert. Zum Beispiel kann man mit der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM) eine Auflösung von etwa 30 nm und mit der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) eine Auflösung von etwa 4 nm erreichen1,5.
Die geringe Etikettiereffizienz ist jedoch bei Standard-ExM-Methoden ein kritisches Problem. Der Fluoreszenzverlust kann je nach Art der Fluoreszenzgruppen und Aufschlusszeit variieren. Im Durchschnitt wurde jedoch berichtet, dass mehr als 50% der Fluorophore nach der Polymerisation und den Proteinverdauungsschritten von ExM verloren gehen, was sich nachteilig auf die Bildqualität auswirkt 3,4.
So wurde die Label-Retention-Expansionsmikroskopie (LR-ExM) entwickelt, die Etiketten effizient zurückhalten und Signalverluste reduzieren kann1. Die Schlüsselinnovation von LR-ExM ist die Verwendung eines Satzes von trifunktionalen Ankern anstelle von Fluoreszenzfarbstoffen – wie im Standard-ExM-Verfahren – zur Färbung von Proteinen von Interesse. Diese trifunktionalen Linker bestehen aus drei Teilen: (1) dem Konnektor (z. B. N-Hydroxysuccinimid (NHS)) zur Verbindung mit dem Antikörper, (2) dem Anker (z. B. Methacrylamid (MA)) zur Verankerung von Proteinen im Polymer und (3) dem Reporter (z. B. Biotin oder Digoxigenin (DIG)) zur Konjugierung mit einem organischen Farbstoff. Die trifunktionellen Anker überleben die Polymerisations- und Proteinverdauungsschritte und verhindern so den Verlust von Fluorophoren.
Darüber hinaus birgt diese Methode großes Potenzial, da sie mit selbstmarkierenden enzymatischen Tags wie SNAP oder CLIP kompatibel ist. Enzymatische Tag-Ansätze haben einige Vorteile gegenüber dem Immunfärbungsansatz in Bezug auf hohe Spezifität und Markierungseffizienz 8,9,10.
In diesem Manuskript wird eine detaillierte Vorgehensweise von LR-ExM demonstriert. LR-ExM ist eine hocheffektive und flexible Methode, um eine hohe räumliche Auflösung bei verbesserter Beschriftungseffizienz zu erreichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Schlüsselinnovation von LR-ExM besteht darin, trifunktionale Anker zu verwenden, um die Zielproteine effektiv zu markieren und die Bildqualität zu verbessern. Diese Methode wird durch trifunktionale Anker begrenzt, die den Forschern nicht so leicht zur Verfügung stehen. Trifunktionale Anker können jedoch auf Anfrage mit anderen Forschern geteilt werden, und ähnliche Produkte wie ExM-Sonden von Chrometa sind jetzt auch kommerziell erhältlich.
In diesem Protokoll wurde eine 1-stündige…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den U.S. National Institutes of Health (R00 GM126136 bis X.S.), der U.S. National Science Foundation (DMS1763272 an S.P.) und der Simons Foundation (594598 an S.P.) unterstützt.
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M’Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
