방법 논문

자연 살해 세포와 통각 수용체 뉴런 사이의 상호 작용을 자극

DOI:

10.3791/63800

⸱

2022년 6월 30일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

통각 수용체 뉴런과 NK 세포는 염증성 맥락에서 활발히 상호 작용합니다. 공동 문화 접근 방식을 통해 이러한 상호 작용을 연구 할 수 있습니다.

초록

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체성 감각 뉴런은 유해한 자극을 감지하고 방어 반사를 활성화하도록 진화했습니다. 통각 수용체 뉴런은 통신 수단을 공유함으로써 면역 체계의 활동을 제어하여 숙주 방어를 조정합니다. 이러한 시스템 간의 통신은 대부분 적응 형이며 항상성을 보호하는 데 도움이되며 만성 질환의 발병을 유발하거나 촉진 할 수도 있습니다. 두 시스템은 1 차 및 2 차 림프 조직과 점막에서 발견되는 것과 같은 국소 상호 작용을 허용하도록 공동 진화했습니다. 최근 연구에 따르면 통각 수용체는 외부 항원, 면역 세포 유래 사이토 카인 및 미생물을 직접 감지하고 반응합니다.

통각 수용체 활성화는 통증 과민증과 가려움증을 유발할 뿐만 아니라 통각 수용체 발사 역치를 낮추어 신경 펩티드의 국소 방출을 유도합니다. 통각 수용체의 말초 말단에 의해 생성되고 방출되는 펩타이드는 림프구의 화학 주성 및 분극을 차단하여 염증의 국소화, 지속 시간 및 유형을 제어 할 수 있습니다. 최근의 증거에 따르면 감각 뉴런은 세포-세포 접촉을 통해 선천성 면역 세포와 상호 작용합니다(예: 자연 살해(NK) 세포에 그룹 2D(NKG2D) 수용체와 결합).

NK 세포가 다양한 통각 수용체 생성 매개체에 대한 동족 수용체를 발현한다는 점을 감안할 때, 통각 수용체는 NK 세포의 활성을 제어하기 위해 신경 펩티드를 사용하는 것으로 생각할 수 있습니다. 여기에서는 접시에서 통각 수용체 뉴런-NK 세포 상호 작용을 연구하는 공동 배양 방법을 고안합니다. 이 접근법을 사용하여 요추 통각 수용체 뉴런이 NK 세포 사이토 카인 발현을 감소 시킨다는 것을 발견했습니다. 전반적으로, 이러한 환원주의적 방법은 종양 신경 분포 뉴런이 NK 세포의 항암 기능을 제어하는 방법과 NK 세포가 손상된 뉴런의 제거를 제어하는 방법을 연구하는 데 유용할 수 있습니다.

서론

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감각 뉴런의 세포체는 등근 신경절 (DRG)에서 시작됩니다. DRG는 척수의 등쪽 뿔과 말초 신경 말단 사이의 말초 신경계 (PNS)에 있습니다. DRG 뉴런의 의사 단극성 특성은 표적 조직을 자극하는 말초 가지에서 체성 감각 정보를 척수1로 전달하는 중앙 가지로 정보를 전달할 수 있습니다. 특수 이온 채널 수용체를 사용하여 1차 뉴런은 병원체, 알레르겐 및 오염 물질2에 의해 제기된 위협을 감지하여 양이온(Na+,Ca 2+)의 유입과 활동 전위 3,4,5의 생성으로 이어집니다.

이 뉴런은 또한 초기 위험 감지가 발생한 주변으로 항드롬 활동 전위를 보내 신경 펩티드 1,4의 국소 방출로 이어집니다. 따라서 통각 수용체 뉴런은 보호 메커니즘으로 작용하여 숙주에게 환경 위험 4,5,6,7을 경고합니다.

2차 뉴런과 통신하기 위해 통각 수용체는 다양한 신경 전달 물질(예: 글루타메이트)과 신경 펩티드(예: 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), 물질 P(SP) 및 혈관 활성 장 펩티드(VIP))를 방출합니다6,7. 이 펩타이드는 모세 혈관에 작용하여 혈장 혈관 외 유출, 부종 및 면역 세포의 국소 유입 및 조절을 촉진합니다 2,4,7.

체성 감각 및 면역계는 사이토 카인 및 신경 펩티드 및 각각의 동족 수용체4로 구성된 공유 통신 시스템을 이용한다. 이 양방향 통신은 위험으로부터 보호하고 항상성을 보존하는 데 도움이 되지만 질병 병태생리학에도 기여할 수 있습니다4.

NK 세포는 선천성 림프 세포로 분류되며 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 데 특화되어 있습니다. NK 세포 기능은 활성화 수용체인 NKG2D8을 비롯한 자극성 및 억제성 수용체의 균형에 의해 지배된다. NKG2D의 내인성 리간드인 레티노산 조기 유도성1(RAE1)은 종양 발생 및 감염 8,9와 같은 스트레스를 받는 세포에서 발현됩니다.

최근 조사에 따르면 말초 신경 손상은 감각 뉴런이 스타스민 2(STMN2) 및 RAE1과 같은 부적응 분자를 발현하도록 유도합니다. 따라서, 세포-세포 접촉 을 통해 , NKG2D-발현 NK 세포는 RAE1-발현 뉴런과의 상호작용에 의해 활성화되었다. 차례로, NK 세포는 손상된 통각 수용체 뉴런과 일반적으로 신경 손상과 관련된 둔기 통증 과민증을 제거 할 수있었습니다10. NKG2D-RAE1 축 외에도 NK 세포는 다양한 통각 수용체 생성 매개체에 대한 동족 수용체를 발현합니다. 따라서 이들 매개체가 NK 세포 활성을 조절하는 것이 가능하다. 이 논문은 통각 수용체 뉴런-NK 세포 상호 작용의 생물학을 조사하는 공동 배양 방법을 제시합니다. 이 접근법은 통각 수용체 뉴런이 부상, 감염 또는 악성 종양에 대한 선천성 면역 세포 반응을 조절하는 방법에 대한 이해를 높이는 데 도움이 될 것입니다.

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프로토콜

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몬트리올 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 (# 22053, # 22054)는 모든 동물 절차를 승인했습니다. 용액 및 조성 목록은 표 1 을 참조하고 이 프로토콜에 사용되는 재료, 장비 및 시약 목록은 재료 표를 참조하십시오.

1. NK세포 분리, 배양 및 자극

  1. 통각 수용체 뉴런을 그대로 생성 (littermate control; TRPV1wt::D TAfl/wt) 및 절제된(TRPV1 cre::D TA fl/wt) 마우스를 TRPV1cre/wt 마우스와 lox-stop-lox-diphtheria 독소 마우스(DTA fl/fl)와 교배시킴으로써 마우스를 배양하였다.
  2. CO2 흡입을 사용하여, 순진한 깔짚 대조군 (TRPV1 wt::D TAfl/wt) 마우스를 안락사시킨다.
  3. 500μL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 비장을 수집합니다.
  4. 유봉을 사용하여 비장을 균질화하십시오.
  5. 세포를 멸균 PBS 1mL로 희석합니다.
  6. 혼합물을 50μm 세포 여과기를 통해 15mL 원뿔형 튜브로 여과합니다.
  7. 멸균 PBS로 부피(10mL)를 채웁니다.
  8. 10 μL를 수집하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
  9. 세포를 원심분리하고(500 × g, 5분) 상청액을 제거한다.
  10. 보충된 RPMI 1640 배지에 108 cells/mL의 농도로 세포를 재현탁합니다.
  11. 제조업체의 지침에 따라 마우스 NK 세포 분리 키트를 사용하여 비장 NK 세포를 자기 정제하십시오. 유세포분석을 이용한 NK 세포 순도 확인11.
  12. 10 μL를 수집하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
  13. 세포를 원심분리(500 × g, 5분)하고 상청액을 제거한다.
  14. NK 세포를 보충된 RPMI 1640 배양액(IL-2 및 IL-15 함유)에 재현탁시킨다.
  15. 96웰 U-바닥 플레이트에서 2 ×10 6 NK 세포/mL를 48시간 동안 배양합니다.

2. DRG 뉴런 분리 및 배양

  1. NK 세포 자극이 끝나기 24시간 전(단계 1.15)에 96웰 플레이트에 100μL/웰의 라미닌(1ng/mL)을 코팅하고 45분(37°C) 동안 배양합니다.
  2. 배양 후 용액을 제거하고 우물을 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조시킵니다.
  3. CO2 흡입을 사용하여, 통각수용체 뉴런을 온전하게 안락사시킨다 (littermate control; TRPV1중량::D TAfl/wt) 또는 절제된(TRPV1cre::D TAfl/wt) 마우스.
    알림: CO2 흡입은 DRG에 연결된 척수 신경을 방해하지 않기 때문에 자궁 경부 탈구보다 선호됩니다.
  4. 마우스를 보드에 엎드린 자세로 고정하고 피부를 들어 올리고 등 지느러미를 따라 피부를 절개하십시오. 자세한 비디오12는 Perner et al.을 참조하십시오.
  5. 요추 관절을 잘라 내고 가위로 요추에서 천골을 분리하십시오.
  6. 두개골의 기저부에 도달 할 때까지 척추 양쪽의 근육과 갈비뼈를 두개골 방향으로 절단하여 척추를 분리하십시오.
  7. 가위를 사용하여 아틀란토 - 후두 관절의 척추를 자릅니다.
  8. 척추에서 근육과 지방 조직을 제거하십시오.
  9. 척추를 고정하고 열어 척수를 제거하고 DRG에 접근합니다. 등쪽 뿌리를 통해 척수에 연결되어 있지만 수막에서 분리 된 추간공에서 DRG를 찾으십시오.
  10. DRG를 얼음처럼 차가운 DMEM 10mL로 채워진 15mL 원뿔형 튜브에 수확합니다.
  11. 제제를 원심분리(200 × g, 5분, 실온)하고 상층액을 제거한다.
  12. 콜라게나제 IV (1 mg / mL) 및 디스파제 II (2.4 U / mL)를 함유 한 PBS 250 μL를 첨가하십시오.
  13. DRG를 콜라게나제 IV/DISPASE II(C/D) 용액(80분, 37°C, 약한 교반)과 함께 배양합니다. 여러 마우스에서 신경절을 풀 때 신경절 당 125 μL의 C / D 용액 비율을 유지하십시오.
  14. 효소를 비활성화하려면 보충된 DMEM 배지 5mL를 추가합니다.
  15. 용액을 원심분리하고(200 × g, 5 분) 피펫을 사용하여 상청액을 부드럽게 제거한다.
  16. 원치 않는 세포 손실을 방지하려면 ~100μL의 상청액을 남겨 두십시오.
  17. 보충된 DMEM 배지 1mL를 추가합니다.
  18. 피펫 건과 크기가 감소하는 3개의 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 DRG를 단세포 제제로 부드럽게 분쇄합니다(파스퇴르 피펫 크기당 ~10 위/아래).
  19. 생물안전 캐비닛에서 소 혈청 알부민(BSA)을 멸균 PBS의 최종 농도 15%로 희석합니다. 1mL 분취량을 -20°C에서 보관하십시오.
  20. 2mL의 멸균 PBS를 추가하고 튜브 바닥에 1mL의 15% BSA 용액을 천천히 분주하여 15mL 원뿔형 튜브에 BSA 그래디언트를 만듭니다. 피펫을 부드럽게 제거하여 그라디언트를 방해하지 마십시오.
  21. P200 피펫을 사용하여 분쇄된 신경절 현탁액(뉴런 포함)을 튜브 측면에 그래디언트로 천천히 피펫팅합니다.
  22. 뉴런 함유 BSA 구배(200×g, 12 분, 실온)를 원심분리합니다. 원심 분리기의 가속 및 감속을 최소 속도로 설정하십시오.
    알림: 원심분리 후 뉴런은 튜브 바닥에 있고 세포 파편은 BSA 구배에 갇히게 됩니다.
  23. 피펫을 사용하여 모든 상청액을 부드럽게 제거합니다.
  24. 500 μL의 신경기저에 세포를 재현탁시킨다.
  25. 라미닌 코팅된 평평한 바닥 96웰 플레이트에 웰당10 개의 4개의 뉴런(신경기저/웰 200μL)을 플레이트합니다.
    참고: 평균적으로 조사자는 마우스당 ~8개의 우물을 채울 수 있습니다.
  26. 뉴런이 부착될 수 있도록 배양(37°C, 하룻밤)하였다.

3. 공동 배양 및 유세포 분석

  1. 뉴런 배양에서 신경 기저부를 천천히 제거하십시오.
  2. IL-2 및 IL-15로 48시간 자극한 후(1.14-1.15단계 참조) NK 세포를 재현탁시키고 105 NK 세포/웰을 뉴런 배양물(96웰 편평 바닥 플레이트)에 추가합니다.
    참고: 평균적으로 조사자는 마우스당 ~6개의 웰을 채울 수 있습니다.
  3. 보충된 신경기저 MX에서 세포를 공동 배양한다(37°C, 48시간).
  4. 세포를 수집하고, PBS(3x)로 세척하고, 원심분리기(500 × g, 5분, 4°C)로 세척한다.
  5. 상청액을 버리고 생존 염료 eFlour-780(1:1,000, 15분, 4°C)으로 세포를 염색합니다.
  6. 세포를 수집하고, PBS(3x)로 세척하고, 원심분리(500 × g, 5분, 4°C)로 세척한다.
  7. CD16/32로 세포의 비특이적 부위를 차단합니다(1:100, 15분, 4°C).
  8. 세포를 수집하고, PBS(3x)로 세척하고, 원심분리기(500 × g, 5분, 4°C)로 세척한다.
  9. 세포를 BV421 항-NK-1.1 (1:100), 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 항-NKp46 (1:100), 및 피코에리트린 (PE) 항-GM-CSF (1:100)로 염색한다.
  10. 세포를 수집하고, PBS(3x)로 세척하고, 원심분리기(500 × g, 5분, 4°C)로 세척한다.
  11. 상층액을 버리고, 세포를 FACS 완충액(500 μL)에 재현탁시키고 NK 세포를 유세포 분석기로 면역표현형을 분석하였다11. 게이팅 전략은 그림 1A 를 참조하십시오.

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결과

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NK 세포를 쓰레기 대조군 (TRPV1 wt : :D TAfl / wt) 마우스 비장 세포로부터 자기 적으로 정제하고 IL-2 및 IL-15로 자극 (48 h)시켰다. 이어서, NK 세포를 단독으로 배양하거나 통각 수용체 뉴런으로부터 채취한 DRG 뉴런과 온전하게 공동 배양하였다(littermate control; TRPV1중량::D TAfl/wt) 또는 절제된(TRPV1cre::D TAfl/wt) 마우스. 이어서, 세포를 TRPV1 작용제 캡사이신 (1 μM) 또는 이의 비히클에 노출시켰다. 공동 배양 24시간 후, NK 세포를 FACS-정제하고, 이들의 활성화 수준을 유세포분석을 사용하여 면역표현형화하였다(도 1A).

단독으로 배양한 경우, NK 세포는 GM-CSF와 NKp46의 기저 수준을 발현하였다. 통...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Davies et al.11 은 손상된 뉴런이 RAE1을 상향 조절한다는 것을 발견했습니다. 세포-세포 접촉 을 통해 NKG2D-발현 NK 세포는 RAE1+ 뉴런을 식별하고 제거할 수 있었고, 이는 차례로 만성 통증을 제한합니다11. NK 세포가 다양한 신경 펩티드 수용체를 발현하고 이러한 신경 펩티드가 면역 조절 능력으로 알려져 있다는 점을 감안할 때 NK 세포와 통각 수용체 뉴런 간의 상호 작용을 시험 관 내에서 연구하는 것이 점점 더 중요 해지고 있습니다. 여기서 우리는 연구자들이 뉴런이 NK 세포 기능을 제어하는 방법과 NK 세포가 DRG 뉴런의 기능을 어떻게 조절할 수 있는지 상호 연구 할 수있는 간단한 공동 배양 프로토콜을 고안했습니다. 유세포 분석은 뉴런이 NK 세포 활성화를 조절하는 방법을 면역표현형에 사용하였다. 또는 조사자는 qPCR 또는 RNA 시퀀싱을 사용하여 FACS 정...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 연구 기금의 새로운 프론티어 (NFRFE201901326), 캐나다 보건 연구소 (162211, 461274, 461275), 캐나다 혁신 재단 (37439), 캐나다 연구 위원장 프로그램 (950-231859), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (RGPIN-2019-06824) 및 퀘벡 자연 및 기술 재단 (253380).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
안티-마우스 CD16/32잭슨 연구소고양이 번호: 017769
B-27잭슨 연구소고양이 번호: 009669
소 혈청 알부민 (BSA) 배양 등급세계 정밀 기기고양이 번호: 504167
BV421 안티-마우스 NK-1.1피셔 사이언티픽고양이 번호: 12430112
세포 여과기 (50 μ m)Fisher Scientific고양이 번호: A3160702
콜라겐분해효소 IVFisher Scientific고양이 번호: 15140148
디프테리아 독소fl/flFisher Scientific고양이 번호: SH3057402
Dispase IIFisher Scientific고양이 번호: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Fisher Scientific고양이 번호: 07-200-95
EasySep 마우스 NK 세포 격리 키트시그마고양이 번호: CLS2595
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)시그마고양이 번호: C0130
FACSAria III시그마고양이 번호: 04942078001
소 태아 혈청(FBS)시그마고양이 번호: 806552
FITC 안티 마우스 NKp46시그마고양이 번호: L2020
평평한 바닥 96웰 플레이트Sigma고양이 번호: 03690
유리 파스퇴르 피펫Sigma고양이 번호: 470236-274
신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF)VWR고양이 번호: 02-0131
LamininCedarlane고양이 번호: 03-50/31
L-글루타민Gibco고양이 번호: A14867-01
마우스 재조합 IL-15Gibco고양이 번호: 22400-089
마우스 재조합 IL-2Gibco고양이 번호: 21103-049
신경 성장 인자(NGF)Life Technologies고양이 번호: 13257-019
Neurobasal mediaPeproTech고양이 번호: 450-51-10
PE 안티-마우스 GM-CSFPeproTech고양이 번호: 212-12
페니실린 및 스트렙토마이신PeproTech고양이 번호: 210-15
유봉줄기세포 기술고양이 번호: 19855
인산염 완충 식염수(PBS)Biolegend고양이 번호: 108732클론 PK136
RPMI 1640 미디어Biolegend고양이 번호: 137606클론 29A1.4
TRPV1CreBiolegend고양이 번호: 505406클론 MP1-22E9
핀셋 및 해부 도구.Biolegend카탈로그 번호: 65-0865-14
U자형 바닥 96웰 플레이트Biolegend카탈로그 번호: 101319
Viability Dye eFlour-780Becton Dickinson

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
  3. Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
  4. Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
  5. Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
  6. Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
  7. Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
  8. Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
  9. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
  10. Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
  11. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333(2021).
  12. Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
  13. Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
  14. Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).

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