Evaluering af fotosyntetisk effektivitet i fotorespiratoriske mutanter ved klorofylfluorescensanalyse

Summary

Vi beskriver en tilgang til måling af ændringer i fotosyntetisk effektivitet i planter efter behandling med lavt CO₂ -indhold ved hjælp af klorofylfluorescens.

Abstract

Fotosyntese og fotorespiration repræsenterer de største kulstofstrømme i plantens primære metabolisme og er nødvendige for plantens overlevelse. Mange af de enzymer og gener, der er vigtige for fotosyntese og fotorespiration, er blevet godt undersøgt i årtier, men nogle aspekter af disse biokemiske veje og deres krydstale med flere subcellulære processer er endnu ikke fuldt ud forstået. Meget af det arbejde, der har identificeret de gener og proteiner, der er vigtige i plantemetabolisme, er blevet udført under stærkt kontrollerede miljøer, der måske ikke bedst repræsenterer, hvordan fotosyntese og fotorespiration fungerer under naturlige og landbrugsmiljøer. I betragtning af at abiotisk stress resulterer i nedsat fotosyntetisk effektivitet, er det nødvendigt at udvikle en skærm med høj kapacitet, der kan overvåge både abiotisk stress og dens indvirkning på fotosyntese.

Derfor har vi udviklet en relativt hurtig metode til at screene for abiotiske stressinducerede ændringer i fotosyntetisk effektivitet, der kan identificere ukarakteriserede gener med roller i fotorespiration ved hjælp af klorofylfluorescensanalyse og lav CO₂ -screening. Dette papir beskriver en metode til at studere ændringer i fotosyntetisk effektivitet i overført DNA (T-DNA) knockout-mutanter i Arabidopsis thaliana. Den samme metode kan anvendes til screening af ethylmethanesulfonat (EMS)-inducerede mutanter eller suppressorscreening. Brug af denne metode kan identificere genkandidater til yderligere undersøgelse i plantens primære metabolisme og abiotiske stressresponser. Data fra denne metode kan give indsigt i genfunktion, der måske ikke genkendes, før den udsættes for øgede stressmiljøer.

Introduction

Abiotiske stressforhold, der almindeligvis ses på landmandens marker, kan påvirke afgrødeudbyttet negativt ved at reducere fotosyntetisk effektivitet. Skadelige miljøforhold som hedebølger, klimaændringer, tørke og jordens saltholdighed kan forårsage abiotiske belastninger, der ændrer CO₂ -tilgængeligheden og reducerer et anlægs reaktion på høj lysstress. De to største terrestriske kulstofstrømme er fotosyntese og fotorespiration, som er afgørende for plantevækst og afgrødeudbytte. Mange af de vigtige proteiner og enzymer, der er involveret i disse processer, er blevet karakteriseret under laboratorieforhold og identificeret på det genetiske niveau¹. Selvom der er gjort store fremskridt med hensyn til at forstå fotosyntese og fotorespiration, forbliver mange trin, herunder transport mellem planteorganeller, ukarakteriserede ^2,3.

Fotorespiration, den næststørste kulstofflux i planter efter fotosyntese, begynder, når enzymet Rubisco fikserer ilt i stedet for kuldioxid til ribulose 1,5 bisphosphat (RuBP), hvilket genererer den hæmmende forbindelse 2-phosphoglycolat (2PG)¹. For at minimere de hæmmende virkninger af 2PG og for at genbruge det tidligere faste kulstof har C3-planter udviklet den multiorganellare proces med fotorespiration. Fotorespiration omdanner to molekyler af 2PG til et molekyle 3-phosphoglycerat (3PGA), som kan komme ind i C3-kulstoffikseringscyklussen¹ igen. Således konverterer fotorespiration kun 75% af det tidligere faste kulstof fra dannelsen af 2PG og forbruger ATP i processen. Som følge heraf er processen med fotorespiration en betydelig 10% -50% træk på den fotosyntetiske proces afhængigt af vandtilgængelighed og vækstsæsontemperaturer⁴.

Enzymerne involveret i fotorespiration har været et forskningsområde i årtier, men kun et lille antal transportproteiner er blevet karakteriseret på det genetiske niveau, selvom mindst 25 transporttrin er involveret i processen ^5,6,7. De to transportproteiner, der er direkte involveret i bevægelsen af kulstof genereret i fotorespirationsprocessen, er plastidglycolat/glycerattransportøren PLGG1 og galdesyrenatriumsymporteren BASS6, som begge er involveret i eksporten af glycolat fra kloroplasten ^5,6.

Under omgivende [CO₂] fikserer Rubisco et iltmolekyle til RuBP ca. 20% af tiden¹. Når planter udsættes for lav [CO 2], øges fotorespirationshastigheden, hvilket gør lav [CO₂] til et ideelt miljø til at teste for mutanter, der kan være vigtige under forhøjet fotorespirationsstress. Test af yderligere formodede kloroplasttransportprotein-T-DNA-linjer under lav CO₂ i 24 timer og måling af ændringer i klorofylfluorescens førte til identifikation af bas6-1 plantelinjer, der demonstrerede en fotorespirationsmutant fænotype⁵. Yderligere karakterisering viste, at BASS6 er en glycolattransportør i kloroplastens indre membran.

Dette papir beskriver detaljeret en protokol svarende til det, der oprindeligt blev brugt til at identificere BASS6 som en fotorespirationstransportør, som kom fra en liste over formodede transportproteiner placeret i kloroplastmembranen⁸ Denne protokol kan bruges i et forsøg med høj kapacitet, der karakteriserer Arabidopsis T-DNA-mutanter eller EMS-genererede mutantplanter som en måde at identificere gener, der er vigtige for at opretholde fotosyntetisk effektivitet under en række abiotiske belastninger såsom varme, høj lysspænding, tørke og CO_{2 –} tilgængelighed. Screening af plantemutanter ved hjælp af klorofylfluorescens er tidligere blevet brugt til hurtigt at identificere gener, der er vigtige for primær metabolisme⁹. Med så meget som 30% af Arabidopsis-genomet, der indeholder gener, der koder for proteiner med ukendt eller dårligt karakteriseret funktion, kan stressinduceret analyse af fotosyntetisk effektivitet give indsigt i molekylære funktioner, der ikke observeres under kontrollerede forhold i mutante planter¹⁰. Målet med denne metode er at identificere mutanter af den fotorespiratoriske vej ved hjælp af en lav CO₂ -screening. Vi præsenterer en metode til at identificere mutanter, der forstyrrer fotorespiration efter udsættelse for lav CO₂. En fordel ved denne metode er, at det er en screening med høj kapacitet for frøplanter, der kan udføres på relativt kort tid. Videoprotokolafsnittene indeholder detaljer om frøforberedelse og sterilisering, plantevækst og lav CO₂ -behandling, konfigurationen af fluorescensbilleddannelsessystemet, måling af kvanteudbyttet af de behandlede prøver, repræsentative resultater og konklusioner.

Protocol

1. Forberedelse og sterilisering af frø BEMÆRK: Frøforberedelse består af frøimbibing og frøsterilisering. Det er vigtigt at bemærke, at alle disse trin skal udføres i en laminær strømningshætte for at opretholde sterile forhold. Alle nødvendige materialer, reagenser og vækstmedier skal autoklaveres (se materialetabellen). Frøimbibation og stratificeringBEMÆRK: De anvendte frølinjer er plgg1-1 (salk_053463), abcb26</e…

Representative Results

Resultaterne viser pladebilleder af rå- og fluorescensbilleder fra omgivende og lav CO2 -screening af WT og testmutanter. Hver plantlet er mærket efter områdenummer, med tilsvarende fluorescensaflæsninger angivet som QY. Dataene eksporteres som en tekstfil og kan åbnes i et regneark til analyse (se supplerende tabel S1). Mutante linjer plgg1-1 og abcb26 blev udvalgt for at demonstrere den positive og negative identifikation af gener forbundet med fotorespiratorisk stress…

Discussion

De eksperimentelle metoder, der er skitseret i dette papir, har nogle fordele og begrænsninger. En fordel er, at denne metode kan screene mange planteplanter, selvom der skal træffes nogle forholdsregler for at forhindre forurening af plantemediepladen under plettering og vækstproces. Derfor er det vigtigt at forsegle Arabidopsis-pladerne med kirurgisk tape. En anden fordel ved dette eksperiment er, at det har en kortere 12 timers fotorespiratorisk stressperiode sammenlignet med det tidligere offentliggjorte arbejde<s…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization