Bewertung der photosynthetischen Effizienz in photorespiratorischen Mutanten mittels Chlorophyllfluoreszenzanalyse
Summary
Wir beschreiben einen Ansatz zur Messung von Veränderungen der photosynthetischen Effizienz in Pflanzen nach Behandlung mit niedrigemCO2 mittels Chlorophyllfluoreszenz.
Abstract
Photosynthese und Photorespiration stellen die größten Kohlenstoffflüsse im pflanzlichen Primärstoffwechsel dar und sind für das Überleben der Pflanzen notwendig. Viele der Enzyme und Gene, die für die Photosynthese und Photorespiration wichtig sind, sind seit Jahrzehnten gut untersucht, aber einige Aspekte dieser biochemischen Wege und ihre Wechselwirkung mit mehreren subzellulären Prozessen sind noch nicht vollständig verstanden. Ein Großteil der Arbeit, die die Gene und Proteine identifiziert hat, die für den Pflanzenstoffwechsel wichtig sind, wurde unter streng kontrollierten Umgebungen durchgeführt, die möglicherweise nicht am besten darstellen, wie Photosynthese und Photorespiration in natürlichen und landwirtschaftlichen Umgebungen funktionieren. In Anbetracht der Tatsache, dass abiotischer Stress zu einer Beeinträchtigung der photosynthetischen Effizienz führt, ist die Entwicklung eines Hochdurchsatz-Screens erforderlich, der sowohl abiotischen Stress als auch seine Auswirkungen auf die Photosynthese überwachen kann.
Daher haben wir eine relativ schnelle Methode entwickelt, um nach abiotischen stressinduzierten Veränderungen der photosynthetischen Effizienz zu suchen, die nicht charakterisierte Gene mit Rollen bei der Photorespiration mithilfe von Chlorophyllfluoreszenzanalyse und niedrigem CO2-Screening identifizieren kann. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung von Veränderungen der photosynthetischen Effizienz in transferierten DNA (T-DNA) Knockout-Mutanten in Arabidopsis thaliana. Die gleiche Methode kann für das Screening von Ethylmethansulfonat (EMS)-induzierten Mutanten oder Suppressor-Screening verwendet werden. Mit dieser Methode können Genkandidaten für weitere Studien im pflanzlichen Primärstoffwechsel und in abiotischen Stressreaktionen identifiziert werden. Daten aus dieser Methode können Einblicke in die Genfunktion geben, die möglicherweise erst erkannt werden, wenn sie erhöhten Stressumgebungen ausgesetzt sind.
Introduction
Abiotische Stressbedingungen, die häufig auf den Feldern von Landwirten auftreten, können sich negativ auf die Ernteerträge auswirken, indem sie die photosynthetische Effizienz verringern. Schädliche Umweltbedingungen wie Hitzewellen, Klimawandel, Dürre und Bodensalzgehalt können abiotische Belastungen verursachen, die die Verfügbarkeit von CO2 verändern und die Reaktion einer Pflanze auf hohen Lichtstress verringern. Die beiden größten terrestrischen Kohlenstoffflüsse sind Photosynthese und Photorespiration, die für das Pflanzenwachstum und die Ernteerträge unerlässlich sind. Viele der wichtigen Proteine und Enzyme, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wurden unter Laborbedingungen charakterisiert und auf genetischer Ebeneidentifiziert 1. Obwohl große Fortschritte beim Verständnis der Photosynthese und Photorespiration erzielt wurden, bleiben viele Schritte, einschließlich des Transports zwischen Pflanzenorganellen, uncharakterisiert 2,3.
Die Photorespiration, der zweitgrößte Kohlenstofffluss in Pflanzen nach der Photosynthese, beginnt, wenn das Enzym Rubisco Sauerstoff anstelle von Kohlendioxid zu Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP) fixiert und die hemmende Verbindung 2-Phosphoglycolat (2PG)1 erzeugt. Um die hemmende Wirkung von 2PG zu minimieren und den zuvor gebundenen Kohlenstoff zu recyceln, haben C3-Pflanzen den multiorganellaren Prozess der Photorespiration entwickelt. Die Photorespiration wandelt zwei Moleküle von 2PG in ein Molekül 3-Phosphoglycerat (3PGA) um, das wieder in den C3-Kohlenstofffixierungszykluseintreten kann 1. So wandelt die Photorespiration nur 75% des zuvor fixierten Kohlenstoffs aus der Erzeugung von 2PG um und verbraucht dabei ATP. Infolgedessen ist der Prozess der Photorespiration eine signifikante Belastung des photosynthetischen Prozesses von 10% -50%, abhängig von der Wasserverfügbarkeit und den Temperaturen in der Vegetationsperiode4.
Die an der Photorespiration beteiligten Enzyme sind seit Jahrzehnten ein Forschungsschwerpunkt, aber nur wenige Transportproteine wurden auf genetischer Ebene charakterisiert, obwohl mindestens 25 Transportschritte am Prozess beteiligt sind 5,6,7. Die beiden Transportproteine, die direkt an der Bewegung des bei der Photorespiration erzeugten Kohlenstoffs beteiligt sind, sind der plastidische Glykolat/Glycerat-Transporter PLGG1 und der Gallensäure-Natriumsymporter BASS6, die beide am Export von Glykolat aus dem Chloroplasten 5,6 beteiligt sind.
Unter Umgebungstemperatur [CO2] fixiert Rubisco ein Sauerstoffmolekül in etwa 20% der Fälle an RuBP1. Wenn Pflanzen niedrigem [CO 2] ausgesetzt sind, steigt die Photorespirationsrate, was ein niedriges [CO2] zu einer idealen Umgebung macht, um auf Mutanten zu testen, die unter erhöhtem Photorespirationsstress wichtig sein können. Das Testen zusätzlicher mutmaßlicher Chloroplasten-Transportprotein-T-DNA-Linien unter niedrigemCO2 für 24 h und die Messung von Veränderungen der Chlorophyllfluoreszenz führten zur Identifizierung von bass6-1-Pflanzenlinien, die einen Photorespirationsmutanten-Phänotyp5 zeigten. Eine weitere Charakterisierung zeigte, dass BASS6 ein Glykolattransporter in der inneren Membran des Chloroplasten ist.
Dieser Artikel beschreibt detailliert ein Protokoll, das dem ähnelt, das ursprünglich zur Identifizierung von BASS6 als Photorespirationstransporter verwendet wurde, das aus einer Liste mutmaßlicher Transportproteine stammt, die sich innerhalb der Chloroplastenmembran befinden8 Dieses Protokoll kann in einem Hochdurchsatzexperiment zur Charakterisierung von Arabidopsis-T-DNA-Mutanten oder EMS-generierten mutierten Pflanzen verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die für die Aufrechterhaltung der photosynthetischen Effizienz unter einer Reihe von abiotischen Belastungen wie Hitze wichtig sind. hohe Lichtbelastung, Trockenheit und CO2 -Verfügbarkeit. Das Screening von Pflanzenmutanten mittels Chlorophyllfluoreszenz wurde in der Vergangenheit verwendet, um schnell Gene zu identifizieren, die für den Primärstoffwechsel wichtigsind 9. Da bis zu 30% des Arabidopsis-Genoms Gene enthalten, die für Proteine mit unbekannter oder schlecht charakterisierter Funktion kodieren, könnte die stressinduzierte Analyse der photosynthetischen Effizienz Einblicke in molekulare Funktionen geben, die unter kontrollierten Bedingungen in mutierten Pflanzen nicht beobachtet werden10. Ziel dieser Methode ist es, Mutanten des photorespiratorischen Weges mittels einesCO2-armen Screenings zu identifizieren. Wir stellen eine Methode vor, um Mutanten zu identifizieren, die die Photorespiration nach Exposition gegenüber niedrigemCO2 stören. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass es sich um ein Hochdurchsatz-Screening für Sämlinge handelt, das in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden kann. Die Videoprotokollabschnitte enthalten Details zur Saatgutvorbereitung und -sterilisation, zum Pflanzenwachstum und zur Behandlung mit niedrigemCO2-Wert , zur Konfiguration des Fluoreszenzbildgebungssystems, zur Messung der Quantenausbeute der behandelten Proben, zu repräsentativen Ergebnissen und zu Schlussfolgerungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in diesem Artikel beschriebenen experimentellen Methoden haben einige Vorteile und Einschränkungen. Ein Vorteil ist, dass diese Methode viele Pflanzensämlinge untersuchen kann, obwohl einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen, um eine Kontamination der Pflanzenmedienplatte während des Galvanisierungs- und Wachstumsprozesses zu verhindern. Daher ist es wichtig, die Arabidopsis-Platten mit chirurgischem Klebeband zu versiegeln. Ein weiterer Vorteil dieses Experiments ist, dass es eine kürzere photorespira…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544) finanziert.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130 (2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
- Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration–the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
- Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
- South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
- Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
- Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880 (2021).
- Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
- Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
- Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
- Hempel, J. J. . Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , (2018).
