엽록소 형광 분석에 의한 광호흡 돌연변이체의 광합성 효율 평가
Summary
우리는 엽록소 형광을 사용하여 낮은CO2 로 처리 한 후 식물에서 광합성 효율의 변화를 측정하는 접근법을 설명합니다.
Abstract
광합성과 광호흡은 식물의 1차 대사에서 가장 큰 탄소 플럭스를 나타내며 식물 생존에 필요합니다. 광합성과 광호흡에 중요한 많은 효소와 유전자는 수십 년 동안 잘 연구되어 왔지만 이러한 생화학 적 경로의 일부 측면과 여러 세포 하 과정과의 혼선은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 식물 대사에 중요한 유전자와 단백질을 확인한 많은 작업은 자연 및 농업 환경에서 광합성과 광호흡이 어떻게 기능하는지 가장 잘 나타내지 않을 수있는 고도로 통제 된 환경에서 수행되었습니다. 비생물적 스트레스가 광합성 효율을 손상시킨다는 점을 고려할 때, 비생물적 스트레스와 광합성에 미치는 영향을 모두 모니터링할 수 있는 고처리량 스크린의 개발이 필요합니다.
따라서, 우리는 엽록소 형광 분석 및 낮은CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡에서 역할을 하는 특성화되지 않은 유전자를 식별할 수 있는 비생물적 스트레스로 인한 광합성 효율의 변화를 스크리닝하는 비교적 빠른 방법을 개발했습니다. 이 논문은 애기장대 탈리아나에서 전달된 DNA(T-DNA) 녹아웃 돌연변이체의 광합성 효율 변화를 연구하는 방법을 설명합니다. 동일한 방법을 에틸 메탄술포네이트(EMS) 유도 돌연변이체 스크리닝 또는 억제기 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 이 방법을 활용하면 식물 1 차 대사 및 비 생물 적 스트레스 반응에 대한 추가 연구를위한 유전자 후보를 식별 할 수 있습니다. 이 방법의 데이터는 증가 된 스트레스 환경에 노출 될 때까지 인식되지 않을 수있는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
농부의 밭에서 흔히 볼 수있는 비 생물 적 스트레스 조건은 광합성 효율을 감소시켜 작물 수확량에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 열파, 기후 변화, 가뭄 및 토양 염분과 같은 해로운 환경 조건은 CO2 가용성을 변경하고 높은 빛 스트레스에 대한 식물의 반응을 감소시키는 비 생물 적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 가장 큰 두 개의 육상 탄소 플럭스는 식물 성장과 작물 수확량에 필수적인 광합성과 광호흡입니다. 이러한 과정에 관여하는 많은 중요한 단백질과 효소는 실험실 조건에서 특성화되었으며 유전 수준1에서 확인되었습니다. 광합성과 광호흡을 이해하는 데 많은 진전이 있었지만 식물 세포 기관 간의 수송을 포함한 많은 단계가 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다 2,3.
광합성 후 식물에서 두 번째로 큰 탄소 플럭스 인 광호흡은 효소 Rubisco가 이산화탄소 대신 산소를 리불 로스 1,5 비스 포스페이트 (RuBP)에 고정시켜 억제 화합물 2- 포스 포 글리콜 레이트 (2PG)1. 2PG의 억제 효과를 최소화하고 이전에 고정 된 탄소를 재활용하기 위해 C3 식물은 광호흡의 다중 세포 기관 과정을 진화 시켰습니다. 광호흡은 2PG의 두 분자를 3-포스포글리세레이트(3PGA)의 한 분자로 변환하여 C3 탄소 고정 주기1에 다시 들어갈 수 있습니다. 따라서 광호흡은 75PG 생성에서 이전에 고정 된 탄소의 2 % 만 변환하고 그 과정에서 ATP를 소비합니다. 결과적으로, 광호흡 과정은 물 가용성 및 성장기 온도에 따라 광합성 과정에서 상당한 10%-50% 드래그입니다4.
광호흡에 관여하는 효소는 수십 년 동안 연구 초점의 영역이었지만 과정 5,6,7에 최소 25개의 수송 단계가 관련되어 있음에도 불구하고 유전적 수준에서 소수의 수송 단백질만 특성화되었습니다. 광호흡 과정에서 생성 된 탄소의 이동에 직접 관여하는 두 가지 수송 단백질은 색소체 글리콜 레이트 / 글리세 레이트 수송 체 PLGG1과 담즙산 나트륨 symporter BASS6이며, 둘 다 엽록체 5,6에서 글리콜 레이트의 수출에 관여합니다.
주변 [CO2]하에서, 루비스코는 산소 분자를 시간의 약 20%의 RuBP에 고정시킨다1. 식물이 낮은 [CO2]에 노출되면 광호흡 속도가 증가하여 낮은 [CO2]가 높은 광호흡 스트레스 하에서 중요할 수 있는 돌연변이를 테스트하기에 이상적인 환경이 됩니다. 24시간 동안 낮은CO2 하에서 추가적인 추정 엽록체 수송 단백질 T-DNA 라인을 테스트하고 엽록소 형광의 변화를 측정하여 광호흡 돌연변이 표현형5를 입증한 bass6-1 식물 라인을 식별했습니다. 추가 특성화는 BASS6가 엽록체의 내막에있는 글리콜 레이트 수송 체임을 입증했습니다.
이 논문은 엽록체 막 내에 위치한 추정 수송 단백질 목록에서 나온 BASS6를 광호흡 수송체로 식별하기 위해 처음에 사용 된 것과 유사한 프로토콜을 자세히 설명합니다.8 이 프로토콜은 열과 같은 다양한 비 생물 적 스트레스 하에서 광합성 효율을 유지하는 데 중요한 유전자를 식별하는 방법으로 Arabidopsis T-DNA 돌연변이 체 또는 EMS 생성 돌연변이 식물을 특성화하는 고 처리량 실험에 사용될 수 있습니다. 높은 가벼운 스트레스, 가뭄 및 CO2 가용성. 엽록소 형광을 이용한 식물 돌연변이체 스크리닝은 1차 대사에 중요한 유전자를 신속하게 식별하기 위해 과거에 사용되어왔습니다9. Arabidopsis 게놈의 30 %가 알려지지 않았거나 잘 특성화되지 않은 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고 있기 때문에 광합성 효율의 스트레스 유도 분석은 돌연변이 식물10에서 통제 된 조건에서 관찰되지 않은 분자 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법의 목표는 낮은CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 경로의 돌연변이체를 확인하는 것이다. 우리는 낮은CO2에 노출 된 후 광호흡을 방해하는 돌연변이를 확인하는 방법을 제시합니다. 이 방법의 장점은 비교적 짧은 시간에 수행 할 수있는 묘목에 대한 고 처리량 스크리닝이라는 것입니다. 비디오 프로토콜 섹션은 종자 준비 및 살균, 식물 성장 및 낮은CO2 처리, 형광 이미징 시스템의 구성, 처리된 샘플의 양자 수율 측정, 대표 결과 및 결론에 대한 세부 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 백서에 설명된 실험 방법에는 몇 가지 장점과 한계가 있습니다. 한 가지 장점은이 방법이 많은 식물 묘목을 스크리닝 할 수 있다는 것입니다., 도금 및 성장 과정에서 식물 매체 플레이트의 오염을 방지하기 위해 몇 가지 예방 조치를 취해야합니다. 따라서 애기장대 판을 수술 용 테이프로 밀봉하는 것이 중요합니다. 이 실험의 또 다른 장점은 이전에 발표 된 작업8에 비해 12 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 루이지애나 이사회 (AWD-AM210544)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
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