Utvärdering av fotosyntetisk effektivitet i fotorespiratoriska mutanter genom klorofyllfluorescensanalys
Summary
Vi beskriver ett tillvägagångssätt för att mäta förändringar i fotosyntetisk effektivitet i växter efter behandling med lågCO2 med klorofyllfluorescens.
Abstract
Fotosyntes och fotorespiration representerar de största kolflödena i växtens primära metabolism och är nödvändiga för växtöverlevnad. Många av de enzymer och gener som är viktiga för fotosyntes och fotorespiration har studerats väl i årtionden, men vissa aspekter av dessa biokemiska vägar och deras överhörning med flera subcellulära processer är ännu inte helt förstådda. Mycket av det arbete som har identifierat de gener och proteiner som är viktiga för växternas ämnesomsättning har utförts under mycket kontrollerade miljöer som kanske inte bäst representerar hur fotosyntes och fotorespiration fungerar under natur- och jordbruksmiljöer. Med tanke på att abiotisk stress resulterar i nedsatt fotosyntetisk effektivitet är utvecklingen av en skärm med hög genomströmning som kan övervaka både abiotisk stress och dess inverkan på fotosyntesen nödvändig.
Därför har vi utvecklat en relativt snabb metod för att screena för abiotiska stressinducerade förändringar av fotosyntetisk effektivitet som kan identifiera okarakteriserade gener med roller i fotorespiration med hjälp av klorofyllfluorescensanalys och låg CO2-screening . Denna artikel beskriver en metod för att studera förändringar i fotosyntetisk effektivitet i överförda DNA (T-DNA) knockout-mutanter i Arabidopsis thaliana. Samma metod kan användas för screening av etylmetanesulfonat (EMS)-inducerade mutanter eller suppressorscreening. Genom att använda denna metod kan man identifiera genkandidater för vidare studier i växtens primära metabolism och abiotiska stressreaktioner. Data från denna metod kan ge insikt i genfunktion som kanske inte känns igen förrän exponering för ökade stressmiljöer.
Introduction
Abiotiska stressförhållanden som vanligtvis ses på jordbrukarens fält kan påverka avkastningen negativt genom att minska fotosyntetisk effektivitet. Skadliga miljöförhållanden som värmeböljor, klimatförändringar, torka, och jordens salthalt kan orsaka abiotiska påfrestningar som förändrar CO2-tillgängligheten och minskar en växts svar på hög ljusstress. De två största markbundna kolflödena är fotosyntes och fotorespiration, som är avgörande för växttillväxt och grödor. Många av de viktiga proteiner och enzymer som är involverade i dessa processer har karakteriserats under laboratorieförhållanden och identifierats på genetisk nivå1. Även om stora framsteg har gjorts när det gäller att förstå fotosyntes och fotorespiration, förblir många steg, inklusive transport mellan växtorganeller, okarakteriserade 2,3.
Fotorespiration, det näst största kolflödet i växter efter fotosyntes, börjar när enzymet Rubisco fixerar syre istället för koldioxid till ribulos-1,5 bisfosfat (RuBP), vilket genererar den hämmande föreningen 2-fosfoglykolat (2PG)1. För att minimera de hämmande effekterna av 2PG och för att återvinna det tidigare fasta kolet har C3-växter utvecklat den multiorganellära processen för fotorespiration. Photorespiration omvandlar två molekyler av 2PG till en molekyl av 3-fosfoglycerat (3PGA), som kan återinträda i C3-kolfixeringscykeln1. Således omvandlar fotorespiration endast 75% av det tidigare fixerade kolet från genereringen av 2PG och förbrukar ATP i processen. Som ett resultat är fotorespirationsprocessen ett signifikant 10%-50% drag på den fotosyntetiska processen, beroende på vattentillgänglighet och växtsäsongstemperaturer4.
Enzymerna som är involverade i fotorespiration har varit ett forskningsområde i årtionden, men endast ett litet antal transportproteiner har karakteriserats på genetisk nivå, även om minst 25 transportsteg är involverade i processen 5,6,7. De två transportproteiner som är direkt involverade i rörelsen av kol som genereras i fotorespirationsprocessen är plastidglykolat/ glycerattransportören PLGG1 och gallsyranatriumsymportern BASS6, som båda är involverade i exporten av glykolat från kloroplasten 5,6.
Under omgivande [CO2] fixerar Rubisco en syremolekyl till RuBP ungefär 20% av tiden1. När växter utsätts för låg [CO 2] ökar fotorespirationshastigheterna, vilket gör låg [CO2] till en idealisk miljö att testa för mutanter som kan vara viktiga under förhöjd fotorespirationsstress. Testning av ytterligare förmodade kloroplasttransportprotein T-DNA-linjer under låg CO2 i 24 timmar och mätning av förändringar i klorofyllfluorescens ledde till identifiering av bas6-1-växtlinjer som visade en fotorespirationsmutant fenotyp5. Ytterligare karakterisering visade att BASS6 är en glykolattransportör i kloroplastens inre membran.
Detta dokument beskriver i detalj ett protokoll som liknar det som ursprungligen användes för att identifiera BASS6 som en fotorespirationstransportör, som kom från en lista över förmodade transportproteiner belägna i kloroplastmembranet8 Detta protokoll kan användas i ett experiment med hög genomströmning som karakteriserar Arabidopsis T-DNA-mutanter eller EMS-genererade mutanta växter som ett sätt att identifiera gener som är viktiga för att upprätthålla fotosyntetisk effektivitet under en rad abiotiska spänningar såsom värme, hög ljusstress, torka och CO2-tillgänglighet . Screening av växtmutanter med klorofyllfluorescens har tidigare använts för att snabbt identifiera gener som är viktiga för primär metabolism9. Med så mycket som 30% av Arabidopsis-genomet som innehåller gener som kodar för proteiner med okänd eller dåligt karakteriserad funktion, kan stressinducerad analys av fotosyntetisk effektivitet ge insikt i molekylära funktioner som inte observerats under kontrollerade förhållanden i mutanta växter10. Målet med denna metod är att identifiera mutanter av den fotorespiratoriska vägen med hjälp av en låg CO2-screening . Vi presenterar en metod för att identifiera mutanter som stör fotorespiration efter exponering för låg CO2. En fördel med denna metod är att det är en screening med hög genomströmning för plantor som kan göras på relativt kort tid. Videoprotokollavsnitten ger detaljer om fröberedning och sterilisering, växttillväxt och låg CO2-behandling , konfigurationen av fluorescensavbildningssystemet, mätning av kvantutbyte för de behandlade proverna, representativa resultat och slutsatser.
Protocol
Representative Results
Discussion
De experimentella metoder som beskrivs i detta dokument har vissa fördelar och begränsningar. En fördel är att denna metod kan screena många växtplantor, även om vissa försiktighetsåtgärder måste vidtas för att förhindra förorening av växtmedieplattan under pläterings- och odlingsprocessen. Därför är det viktigt att försegla Arabidopsis-plattorna med kirurgisk tejp. En annan fördel med detta experiment är att det har en kortare 12 h fotorespiratorisk stressperiod jämfört med det tidigare publicera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130 (2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
- Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration–the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
- Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
- South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
- Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
- Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880 (2021).
- Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
- Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
- Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
- Hempel, J. J. . Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , (2018).
