Análise da Morfologia Organoide Retal (ADM): Um Ensaio Diagnóstico na Fibrose Cística
Summary
Este protocolo descreve a análise da morfologia organoide retal (ADM), um novo ensaio diagnóstico para fibrose cística (FC). As características morfológicas, nomeadamente a arredondamento (índice de circularidade, IC) e a presença de um lúmen (razão de intensidade, RI), são uma medida da função CFTR. A análise de 189 sujeitos mostrou perfeita discriminação entre FC e não FC.
Abstract
O diagnóstico de fibrose cística (FC) nem sempre é simples, especialmente quando a concentração de cloreto no suor é intermediária e/ou inferior a duas mutações da CFTR causadoras da doença podem ser identificadas. Ensaios fisiológicos de CFTR (diferença de potencial nasal, medição da corrente intestinal) foram incluídos no algoritmo de diagnóstico, mas nem sempre estão prontamente disponíveis ou viáveis (por exemplo, em lactentes). Os organoides retais são estruturas 3D que crescem a partir de células-tronco isoladas de criptas de uma biópsia retal quando cultivadas sob condições específicas. Os organoides de indivíduos não-FC têm uma forma redonda e um lúmen cheio de fluido, já que o transporte de cloreto mediado por CFTR leva a água para o lúmen. Organoides com função CFTR defeituosa não incham, mantendo uma forma irregular e não tendo lúmen visível. As diferenças na morfologia entre organoides CF e não-CF são quantificadas na ‘Rectal Organoid Morphology Analysis’ (ROMA) como um novo ensaio fisiológico CFTR. Para o ensaio de ROMA, os organoides são banhados em placas de 96 poços, corados com calceína e fotografados em microscópio confocal. As diferenças morfológicas são quantificadas usando dois índices: o índice de circularidade (IC) quantifica a arredondamento dos organoides e a razão de intensidade (RI) é uma medida da presença de um lúmen central. Os organoides não-CF têm um IC alto e um IR baixo em comparação com os organoides da FC. Os índices de ROMA discriminaram perfeitamente 167 indivíduos com FC de 22 indivíduos sem FC, tornando a ROMA um ensaio fisiológico atraente de CFTR para auxiliar no diagnóstico de FC. As biópsias retais podem ser realizadas rotineiramente em todas as idades na maioria dos hospitais e o tecido pode ser enviado para um laboratório central para cultura de organoides e ROMA. No futuro, a ROMA também pode ser aplicada para testar a eficácia dos moduladores CFTR in vitro. O objetivo do presente relatório é explicar completamente os métodos utilizados para ROMA, para permitir a replicação em outros laboratórios.
Introduction
A fibrose cística (FC) é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene do regulador de condutância transmembrana da FC (CFTR). A proteína CFTR é um canal de cloreto e bicarbonato, garantindo a hidratação de vários epitélios1. A FC é uma doença multissistêmica de alta carga, que encurta a vida, manifestando-se principalmente como uma doença respiratória, mas também afetando o trato gastrointestinal, pâncreas, fígado e trato reprodutivo2.
As mutações do CFTR causadoras de doenças levam a uma diminuição na quantidade ou função do CFTR , por sua vez, causando desidratação do muco. Mais de 2.000 variantes no gene CFTR foram descritas3, das quais apenas 466 foram completamente caracterizadas4.
O diagnóstico de FC pode ser feito quando a concentração de cloreto no suor (CCE) está acima do limiar de 60 mmol/L ou quando duas mutações CFTR causadoras de doenças (de acordo com o banco de dados CFTR2) são identificadas 4,5. Em indivíduos com CEC apenas intermitentemente elevado (30-60 mmol/L), que ocorre em cerca de 4%-5% dos testes de suor6, e mutações CFTR de consequência clínica variável ou desconhecida, o diagnóstico não pode ser confirmado nem descartado, mesmo quando apresentam sintomas compatíveis com FC ou teste de triagem neonatal positivo. Para esses casos, ensaios fisiológicos de CFTR de segunda linha (diferença de potencial nasal (NPD) e medidas de corrente intestinal (ICM)) foram incluídos no algoritmo diagnóstico. Esses testes não estão prontamente disponíveis na maioria dos centros nem são viáveis em todas as idades, especialmente em lactentes5.
Os organoides retais são estruturas 3D cultivadas a partir de células-tronco intestinais adultas Lgr5(+) de criptas intestinais obtidas através de biópsia retal7. Os organoides estão sendo cada vez mais utilizados em pesquisas biomédicas, como o teste de tratamento de moduladores na FC8. Uma biópsia viável pode ser obtida por sucção ou biópsia a fórceps, procedimento que causa apenas um mínimo de desconforto e é seguro mesmo em lactentes, com baixas taxas de complicações9. As criptas isoladas das biópsias retais são enriquecidas em células-tronco e, sob condições específicas de cultivo, estas se auto-organizam em organoides retais. A morfologia desses organoides é determinada pela expressão e função da CFTR, localizada na membrana apical das células epiteliais. O CFTR funcional permite que o cloreto e a água entrem no lúmen organoide, induzindo assim o inchaço dos organoides não-CF. Os organoides da FC não incham e não apresentam lúmen visível10,11.
A análise da morfologia organoide retal (ADM) permite a discriminação entre organoides FC e não FC com base nessas diferenças na morfologia organoide. Os organoides não-CF são mais redondos e têm um lúmen visível, enquanto o oposto é verdadeiro para os organoides da FC. Para este ensaio, os organoides específicos do paciente são banhados em 32 poços de uma placa de 96 poços. Após 1 dia de crescimento, os organoides são corados com verde calceína e fotografados em um microscópio confocal. Os organoides não-FC apresentam uma forma mais circular e uma parte central menos fluorescente, pois o lúmen contém fluido e a calceína mancha apenas células. Essas diferenças na morfologia são quantificadas usando dois índices de ROMA: o índice de circularidade (IC) quantifica a arredondamento dos organoides, enquanto a razão de intensidade (RI) é uma medida da presença ou ausência de um lúmen central. Neste relato, descrevemos detalhadamente o protocolo para obtenção desses índices discriminativos, para permitir a replicação da técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fornecemos um protocolo detalhado para análise da morfologia organológica retal (ADM). Os dois índices calculados com ROMA, RI e IC distinguiram organoides de indivíduos com FC daqueles sem FC com perfeita acurácia. A ROMA poderia, assim, funcionar como um novo ensaio fisiológico de CFTR complementar ao CEC e a outros testes atualmente disponíveis13,14,15.
O protocolo é dependente do uso de or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos pacientes e pais que participaram deste estudo. Agradecemos a Abida Bibi por todo o trabalho de cultivo com os organoides. Agradecemos a Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz e Bernard Wenderickx pelo apoio logístico. Também agradecemos ao Mucovereniging/Association Muco, e especificamente a Stefan Joris e ao Dr. Jan Vanleeuwe, por seu apoio e financiamento. Agradecemos a todos os colaboradores do Projeto Organoide Belga: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Bélgica), Linda Boulanger (Hospitais Universitários de Lovaina, Bélgica), Georges Casimir (HUDERF, Bruxelas, Bélgica), Benedicte De Meyere (Hospital Universitário de Ghent, Bélgica), Elke De Wachter (Hospital Universitário de Bruxelas, Bélgica), Danny De Looze (Hospital Universitário de Ghent, Bélgica), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bruxelas, Bélgica), Laurence Hanssens (HUDERF, Bruxelas), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bruxelas, Bélgica), Monique Lequesne (Hospital Universitário de Antuérpia, Bélgica), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antuérpia), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antuérpia), Stephanie Van Biervliet (Hospital Universitário de Gante, Bélgica), Eva Van Braeckel (Hospital Universitário de Gante, Bélgica), Kim Van Hoorenbeeck (Hospital Universitário de Antuérpia, Bélgica), Eef Vanderhelst (Hospital Universitário de Bruxelas, Bélgica), Stijn Verhulst (Hospital Universitário de Antuérpia, Bélgica), Stefanie Vincken (Hospital Universitário de Bruxelas, Bélgica).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
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